作者：熊志刚 李建平 唐丽 陈志强
【摘要】 通过交联剂将葡萄糖氧化酶（god）固定在fe3o4磁性纳米粒子上，在磁力作用下将该磁性复合粒子修饰在石蜡碳糊电极（spce）表面，制成易更新酶电极。god催化氧化葡萄糖生成过氧化氢，并使鲁米诺产生电致化学发光(ecl)，据此首次构建了易更新型电致化学发光葡萄糖传感器。其电致发光强度与葡萄糖浓度在1×10－5～1.0×10－2 mol/l范围内呈线性关系，线性回归方程i＝65.4374c+23.9017（r=0.9987）； 检出限为1.0 μmol/l。此传感器响应快， 稳定性高， 表面易更新，已用于测定人血清中葡萄糖的含量。
【关键词】 电致化学发光; 磁性纳米粒子； 葡萄糖氧化酶； 鲁米诺； 化学修饰电极
abstract a novel nanofe3o4 particles biosensor for glucose based on luminol electrochemiluminescence (ecl) is presented. glucose oxidase (god) was covalently crosslinked to the surface of synthesized magnetic nanofe3o4 particles. then the composite particles fe3o4/god was adhered to solid paraffin carbon paste electrode by magnetic force to fabricate a working electrode. hydrogen peroxide was produced by enzymatic reaction of god and ecl could be obtained by the reaction between luminol and hydrogen peroxide to construct the renewable glucose biosensor. there was a linear relationship between ecl and glucose concentration in the ranges of 1×10－5－1.0×10－2 mol/l with a regression equation of i＝65.4374c+23.9017(r=0.9987), and the detection limit is 1 μmol/l. the ecl biosensor has showed short response time and high stability, and the electrode surface was renewable easily. the proposed biosensor has been applied to the determination of glucose in plasma samples.
keywords electrochemiluminescence; magnetic nanoparticles; glucose oxidase; luminol; chemically modified electrode
1 引 言
电致化学发光（ecl)是在化学发光的基础上，结合电极反应发展起来的一种化学发光法[1～3]。wWw.11665.cOM利用葡萄糖氧化酶（god）催化氧化葡萄糖生成h2o2可以构建葡萄糖ecl传感器。在ecl葡萄糖传感器研究中，god的固定方法是一个重要课题。常用的酶固定化方法有吸附法[4]、包埋法[5]、共价键合法及交联法[6,7]，电化学聚合法［８］。这些方法制备ecl酶传感器过程烦琐、复杂，电极表面敏感膜不易更新。
在酶传感器中采用纳米材料为载体，不仅可以增加酶的固定量和稳定性，而且还可以提高酶的催化活性，进而提高酶电极的响应灵敏度[９]。fe3o4磁性纳米粒子具有纳米粒子的诸多优点，又具有非常好的生物相容性，在外加磁力的作用下能非常方便地实现电极敏感膜的更新，故在酶传感器研究中得到了广泛应用[１０～1７]。但是在ecl葡萄糖传感器中，使用fe3o4磁性纳米粒子固定god还未见报道。本研究通过交联剂将god共价固定在fe3o4磁性纳米粒子表面，再通过磁力将此固载酶的磁性纳米粒子修饰在spce表面，从而制成了易更新的酶传感器，并用于葡萄糖的ecl分析。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
mpie型电致化学发光分析系统（西安瑞迈分析仪器有限公司）; m1703型红外光谱仪（perkinelmer公司）; 三电极系统：工作电极为自制的磁性纳米粒子固定酶修饰电极（god/fe3o4/spce/cme），参比电极为ag/agcl饱和kcl电极，铂丝为对电极；bransonic200超声清洗仪(德国branson ultraschall公司)；phs2c型精密酸度计（上海雷磁精密仪器有限公司）。
3氨基丙基三乙氧基硅烷(aps，98%, alfa aesar公司）；葡萄糖氧化酶(god，120 u/mg，sigma公司）；标准葡萄糖储备液，放置过夜后使用，保存于4 ℃冰箱中。鲁米诺(＞98%，fluka公司）; 戊二醛(25%，上海化学试剂厂）；其它试剂均为分析纯。实验用水为二次蒸馏水(18.2 mω·cm)。
2.2 酶传感器的制作
2.2.1 固体石蜡碳糊电极的制作
参考文献[1３]，取3 cm长的铁棒(外径 2.55 mm)和2 cm长的玻璃管(3.0 mm i.d)，磨平铁棒和玻璃管的两端，用水洗净。按一定比例混合固体石蜡和碳粉，加热熔化石蜡，均匀搅拌，制得石蜡碳糊。把铁棒插入玻璃管中距底部约0.5 mm，形成一个凹坑，趁热将石蜡碳糊封装进此凹坑，填平，冷却，除去玻璃壁外的沾粘的碳糊，并在光滑打印纸抛光电极表面。然后分别用hno3（1∶1， v/v）、无水乙醇和二次蒸馏水清洗电极。在1.0 mol/l h2so4溶液中采用循环伏安（cv）法活化作为工作电极的spce，扫描范围1.2～－1.2 v。再于5 mmol/l k3fe(cn)6溶液中循环扫描，扫描范围改为0.5～－0.2 v。重复上述步骤直至得到峰形良好的一对可逆氧化还原峰。
2.2.2 磁性纳米粒子的制备、氨基化和葡萄糖氧化酶修饰
按照n(fe2+)∶n(fe3+) = 1∶1.75称取适量fecl3·6h2o和feso4·7h2o，溶于水中。搅拌下快速加入适量 2.0 mol/l naoh溶液，调ph值至11.0，室温下搅拌0.5 h，迅速升温到75 ℃，熟化0.5 h，整个过程都在氮气的保护下进行，得黑色悬浮液。超声15 min，磁铁分离不溶物，用水洗涤至溶液呈中性。在75 ℃下真空干燥，得粉末，4 ℃下密闭保存在。
取20 ml乙醇，加入50 mg fe3o4纳米粒子粉末，超声分散，之后加入0.2 ml 3氨基丙基三乙氧基硅烷（98%），在氮气的保护下，25 ℃搅拌12 h制得氨基化的磁性纳米粒子，用无水乙醇、水超声清洗后定容至20 ml备用。
取2.0 ml上述溶液于5 ml试管中，晾干，再于试管中加入2.0 ml 0.25%戊二醛，混旋30 s后，放入4 ℃冰箱冷藏1 h，之后水洗并晾干，再加20 g/l god溶液2.0 ml，于4 ℃冰箱中保存12 h，制得god修饰的磁性粒子溶液（god/ fe3o4）。图1为磁性纳米粒子固定葡萄糖氧化酶的示意图。
2.2.3 自组装磁性纳米复合粒子修饰电极
spce电极面朝上，用磁铁吸住电极上端铁芯，滴加15 μl god/fe3o4粒子在电极表面，制得酶修饰电极（god/fe3o4/spce/cme）。测定时将电极面对准光电倍增管检测方向。每次更新电极时，移去磁铁，水洗去磁性复合粒子，之后重复上述过程以更新电极。
2.3 ecl传感器原理和实验方法
ecl传感器的原理如图2。god/fe3o4复合磁性纳米粒子通过外加磁场而修饰在spce电极表面。此时，溶液中的葡萄糖与溶解氧发生god酶促反应，生成h2o2。同时，溶液中的鲁米诺在修饰电极表面发生氧化，鲁米诺氧化物与h2o2发生ecl反应。god/fe3o4复合磁性纳米粒子的存在促进了鲁米诺的氧化和h2o2生成。在本实验中，室温下，将10 ml含一定浓度的葡萄糖的0.5 mmol/l鲁米诺 0.1 mol/l硼酸钠缓冲溶液(ph=8.0)转至石英烧杯中，然后采用三电极系统进行测试，并测定ecl的强度。扫描范围为0.2～1.4 v(vs. sce)，扫速为50 mv/s。光电倍增管高压600 v，采样速率10 t/s，放大倍数3，测量时间60 s。spce不用时置于冰箱中4 ℃下保存。
３ 结果与讨论
3.1 fe3o4纳米粒子的表征
３．１．１ fe3o4纳米粒子粒度分析
用激光散射仪（英国malvern公司）测定fe3o4纳米粒子粒径。从图3可见，本实验所制备的fe3o4磁性粒子粒径主要分布在12～22 nm之间。说明磁性纳米粒子已经达到纳米级，且粒径分布较为集中，因此，可用于后续实验。
3.１．2 fe3o4纳米粒子的氨基功能化表征
用红外光谱表征fe3o4粒子表面氨基化修饰前后的变化。由图4可见，在fe3o4粒子表面功能化修饰了氨基基团，fe3o4粒子与氨基化fe3o4粒子都具有fe3o4粒子特征峰（583.235 cm－1）；氨基化fe3o4粒子具有sio的伸缩振动特征峰（1409.675 cm－1）和氨基弯曲振动特征峰（1638.335 cm－1）。
3.１．3 酶复合磁性粒子的磁力测定
用振动样品磁强计(par115型)对移去磁铁而洗脱获得的酶复合磁性粒子进行磁力测量。复合粒子矫顽力较低，同时未见明显的剩磁和磁滞现象，其比饱和磁化强度σ仅为42.1 emu/g（图5）。由此可见，fe3o4 /god复合粒子具有较强超顺磁性即在外磁场存在下有磁性，外撤除磁场则磁性消失，故可用于磁性分离。
3.２ 酶电极的ecl行为
fe3o4/god（a）和fe3o4（b）粒子分别修饰的spce，在10 ml含0.1 mmol/l鲁米诺和1.0 mmol/l葡萄糖+0.1 mol/l硼酸钠缓冲溶液(ph= 8.0)中进行cv实验所得到ecl图(见图6)。实验条件：电位扫速为50 mv/s，扫描范围为0.2～1.4 v，采样速率10 t/s，放大倍数3。由图6可见，修饰在电极表面的fe3o4粒子表面成功地共价固定了god，从而催化氧化葡萄糖生成鲁米诺ecl所需的h2o2。
3.3 缓冲液种类、ph值和温度的影响
研究了3种缓冲液: 0.1 mol/l硼酸钠、0.1 mol/l hacnaac和pbs(ph=8.0)作为支持电解质的影响。结果表明，0.1 mol/l硼酸钠缓冲溶液中ecl响应最高。
鲁米诺的ecl反应需在弱碱性条件下进行，考虑到葡萄糖氧化酶的生物活性受ph值影响较大，本研究考察了ph在7.0～9.5时ecl强度的变化。其中鲁米诺浓度为0.1 mmol/l，葡萄糖浓度为1.0 mmol/l。当ph=8.0时，鲁米诺的ecl强度最大，本实验选取ph=8.0。
酶的催化活性受温度影响较大。本实验用集热式恒温加热磁力搅拌器控制水浴温度，考察了20～60 ℃范围内酶电极的电流响应。当温度达到40 ℃时，响应最大。综合考虑温度对葡萄糖氧化酶电极寿命的影响，本实验均在室温25 ℃下进行。
3.４ 鲁米诺浓度的影响
本实验考察了鲁米诺的浓度在0.01～1.2 mmol/l范围内对ecl强度的影响（图7）。由图7可知，随着鲁米诺的浓度由0.01 mmol/l增大到0.5 mmol/l时，溶液的ecl强度快速增大，之后趋于平稳饱和。因此，实验中鲁米诺的浓度为0.5 mmol/l。
3.５ 葡萄糖的分析
取10 ml石英小烧杯，加入含一系列不同浓度的葡萄糖0.1 mol/l硼酸钠缓冲溶液(ph= 8.0)10 ml，此时鲁米诺浓度为0.5 mmol/l，按上述方法测定ecl的强度（图8）。葡萄糖在1×10－5～1.0×10－2 mol/l浓度范围内与ecl强度呈良好的线性关系：i＝65.4374c+23.9017， r=0.9987； 检出限为1 μmol/l； 酶电极的响应时间约为10 s。
3.６ 葡萄糖传感器的重现性、稳定性和选择性
通过移除ecl葡萄糖传感器上方的磁铁，用水冲spce电极表面，在0.5 mol/l hcl中清洗0.5 min，从而去除磁性复合粒子。重复2.2.2节的修饰过程，可实现磁性复合粒子的更新。每次电极更新后对1.0 mmol/l的葡萄糖进行测定，其rsd=3.9%（n=5）。而对于5批次相同条件下制得的传感器，其rsd=4.5%。考察一个月内组装有磁性复合粒子的工作电极对葡萄糖响应情况（不使用时，电极放置在4 ℃冰箱中保存）。结果表明，７天内电极响应基本不变，cv和ecl曲线形状也基本不变；１４天后ecl强度约为原来的95%；１月后ecl强度下降85%。显然，用本实验方法固定god在fe3o4纳米粒子表面，能在微环境下保持生物蛋白的活性，从而获得较好的稳定性。
考察了一些常见干扰物质对测定5.0×10－5 mol/l葡萄糖的影响。结果表明，10倍的尿酸和抗坏血酸对葡萄糖的检测的影响均<5%，说明本方法选择性好，这归功于酶促反应特异性和ecl的高灵敏度。
３．７ 临床血清样品测试分析
按照实验方法对人血清样品（桂林理工大学附属医院提供）中葡萄糖的含量进行测定，结果见表1。结果表明，本方法测定结果与医院提供的临床分析结果相吻合。采用标准加入法测定了样品的回收率。表1 人血清中葡萄糖的测定及回收率实验结果（略）
从表１可见，测定结果与参考值基本吻合，回收率在95.2%～104%之间。说明本方法可用于临床样品的测定。
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