【摘要】 目的 采用超声联合酶法对黄芪总多糖进行有效提取。方法 通过单因素实验考察超声提取时间、超声提取温度、固液比及酶用量对黄芪总多糖提取率的影响，并运用正交试验优化其提取工艺。结果 影响黄芪总多糖提取率的因素按大小次序排列为：超声提取时间>超声提取温度>酶量>固液比，优化工艺参数为：超声提取时间30 min、超声提取温度40 ℃、固液比1∶20(g∶ml)、酶量10 mg。结论 与黄芪多糖的传统水提工艺相比，采用超声联合酶法进行提取，黄芪多糖的提取率明显提高，优选得到的工艺稳定可行。
【关键词】 超声酶法;黄芪;总多糖;正交试验
abstract:objective to study on a novel extraction process of astragalus polysaccharides by ultrasound combined with cellulose enzyme. methods the optimum extracting conditions were tested with orthogonal experimental design. results the significance of these factors in sequence were enzyme amount,solid/liquid ratio,ultrasound temperature and ultrasound extraction time.the optimal parameters were: ultrasound time of 30 min,ultrasound temperature of 40 ℃,solidliquid ratio 1∶20,the enzyme amount of 10 mg. conclusion the optimal process of ultrasound combined with cellulose enzyme is available and workable for high yield of total aps compared with traditional water extraction.
key words:ultrasound combined with enzyme; astragalus mongholicus; total polysaccharides; orthogonal experiment
黄芪为豆科植物黄芪astragalusmembranaceus(fisch.)bge. var.mongholicus(bge) hsiao或荚膜黄芪astragalusmembranaceus(fisch.) bge的干燥根。www.11665.CoM具有补气固表、利尿脱毒、排脓、敛疮生肌的功效,为历代常用之补益中药。黄芪多糖(astragalus polysaccharides,aps)是黄芪中重要的天然有效活性成分,具有促进免疫器官功能和抗体生成,抗菌抗病毒及抗肿瘤,抗衰老，防辐射,双向调节血糖等作用[1,2]。由于其多种生物活性及良好的临床效果,多年来在国内外已成为中药提取及中草药 现代 化研究的焦点之一[3]。目前已有黄芪多糖冲剂、黄芪精口服液、黄芪注射液等药品应用于临床,其提取工艺的选择直接影响到药品的质量。
目前黄芪多糖的提取主要采用传统的水提工艺,多糖粗品的收率极低,而提取成本却很高,使得黄芪多糖的开发利用受到限制。酶技术是近年来用于植物有效成分提取的生物工程技术，选用恰当的酶可以比较温和地将植物组织分解，加速有效成分的释放，从而提高其提取率[4,5]。超声提取法是基于超声波的空化作用来加速物质分子运动的频率和速度、增加溶剂穿透能力,以提高药物溶出速度和溶出次数,从而有利于植物有效成分溶出的一种提取方法,同时它还避免了高温加热对有效成分的破坏。基于酶法与超声提取法的优点，作者首次采用超声联合纤维素酶法提取黄芪中的总多糖，通过正交试验确定最优提取工艺，旨在提高黄芪多糖的得率，最大限度地利用黄芪资源，为其 工业 化生产提供 参考 依据。
1 仪器与试剂
1.1 仪器
hh6恒温水浴锅(江苏金坛市宏华仪器厂);re52cs旋转蒸发器(巩义市英峪予华仪器厂);循环水真空泵(河南省巩义市英峪予华仪器厂);uv1101紫外/可见分光光度仪(上海天美 科学 仪器有限公司);ay120 电子 分析天平(日本岛津公司);kh400kdb型高功率数控超声清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司，频率40 khz，功率400 w);摇摆式高速中药粉碎机(大德中药机械有限公司)。
1.2 试剂
葡萄糖对照品(分析纯，纯度≥99%,广州汕头市西陇化工厂);纤维素酶 (活性单位≥15 u·mg-1)由上海伯奥生物科技有限公司提供。黄芪药材(购自广州致信中药饮片有限公司，批号：08207)。实验用水为蒸馏水，其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 样品前处理
将黄芪药材经粉碎机粉碎后过40目筛，备用。
2.2 葡萄糖对照品溶液的制备
精密称取葡萄糖对照品25.0 mg，置50.0 ml容量瓶中，加入蒸馏水溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得(每1 ml中含葡萄糖0.500 mg)。
2.3 标准曲线的制备
分别精密吸取上述葡萄糖对照品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 ml至7个25 ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。分别精密吸取1.0 ml于试管中，于冰水浴条件下缓慢加入5%苯酚溶液1.0 ml，摇匀，迅速加入浓硫酸溶液5.0 ml，振摇5 min，沸水浴10 min，然后置冷水浴中冷却20 min。同时以苯酚-浓硫酸溶液作为空白对照，在 490 nm处测量其吸光度值。以葡萄糖的质量浓度(ρ)为横坐标,溶液的吸光度(a)为纵坐标，绘制标准曲线。经回归分析，得标准曲线方程：a=13.154ρ+0.0158，r=0.998 1。葡萄糖的质量浓度在0.02～0.12 mg·ml-1范围内与吸光度线性关系良好。
2.4 黄芪中黄芪多糖提取率的测定
取黄芪中黄芪多糖提取液用紫外分光光度计于490 nm下测出吸光度a，代入回归方程及以下公式，即可 计算 出黄芪中黄芪多糖的提取率。
提取率(%)=c×v×10-3w×100%
式中：c为黄芪多糖提取液浓度(mg·ml-1)，v为定容体积(ml)，w为黄芪药粉质量(g)。
2.5 酶解条件的确定
2.5.1 考察酶解时间对提取率的影响 称取黄芪粉1 g，进行酶解试验。酶解温度为50 ℃，料液比为1∶20，酶量为8 mg，根据 文献 [4]选择ph=4.5，考察不同酶解时间对提取率的影响。当酶解时间为30、60、90、120、150 min时，提取率分别是19.05%、21.75%、22.31%、22.13%、20.82%。在考察范围内随着酶解时间的增加，黄芪多糖的提取率呈先上升后下降的趋势。为节省时间，选择酶解时间为60 min。
2.5.2 考察酶解温度对提取率的影响 称取黄芪粉1 g，进行酶解试验。酶解时间60 min，料液比为1∶20，酶量为8 mg，ph=4.5。当酶解温度分别为30、40、50、60、70 ℃时，提取率分别是19.01%、22.01%、23.84%、22.39%、21.08%。随着酶解温度的增加，黄芪中多糖的提取率呈先上升后下降趋势，50 ℃时提取率最高。因此本实验选择酶解温度为50 ℃。
2.5.3 考察酶用量对提取率的影响(见“2.6”)
2.6 单因素实验
取黄芪约 1 g，精密称取，加入缓冲溶液和一定比例的酶，按“2.5”项下确定的酶解条件(酶解时间60 min，酶解温度50 ℃，ph=4.5)，在不同条件下进行提取，滤过，按“2.3”项下方法测定其吸光度，以考察超声提取时间、超声提取温度、固液比及酶用量对黄芪总多糖提取率的影响，结果见图1。
2.7 正交试验
根据单因素试验结果，设计了四因素三水平正交试验，结果见表1、表2、表3。
由表2可以看出，在影响超声酶法提取黄芪多糖的四个因素中，影响黄芪多糖提取率的大小次序先后为超声提取时间>超声提取温度>酶量>固液比，超声提取时间影响最大，固液比影响最小。各因素的优化工艺参数为a2b2c2d3，即超声时间30 min、超声温度40 ℃、固液比1∶20、酶量10 mg。
