作者：庄满贤，陈地灵，陈永刚，林励
【摘要】 目的 研究储存期对毛橘红黄酮类物质含量的影响，为毛橘红有效储存期的确立提供依据。方法 取毛橘红样品3批，在室温条件下贮藏放置，分别于第0、1、2、3、6、9、12个月时取样，用紫外分光光度法测定其总黄酮的含量，高效液相色谱法测定其柚皮苷和野漆树苷的含量。将各时期相关数据进行比较分析，得出毛橘红黄酮类物质在12个月内的含量变化 规律 。结果 毛橘红总黄酮、柚皮苷和野漆树苷含量在12个月内基本稳定。结论 毛橘红的储存期暂定为1年。
【关键词】 储存期;毛橘红;总黄酮;柚皮苷;野漆树苷;变化规律
abstract:objective to study on the flavonoids content in citri grandis of different storage to establish the effective storage period for citri grandis. methods the contents of total flavonoids in three batches of citri grandis placed for 12 months under room temperature in the beginning point、1 st、2 nd、3 rd、6 th、9 th、12 th month were determined by ultravioletvisible absorption spectroscopy,and the contents of naringin and rhoifolin were determined by hplc. results the contents of total flavonoids，naringin and rhoifolin of citri grandis are steady in one year. conclusion the storage period of citri grandis is tentatively set for one year.
key words:storage; citri grandis; total flavonoid; naringin; rhoifolin; varying pattern
毛橘红为广东化州产“道地药材”，其原植物为化州柚citrus grandis ‘tomentosa’，明代万历年间的《高州府志》“物产”部分载有“化州橘红为化州独有”。wWw.11665.CoM黄酮类成分是毛橘红的主要有效成分之一[1]，柚皮苷和野漆树苷含量较高。本试验研究不同储存时间对毛橘红黄酮类物质含量的影响，为药材有效储存期的确定提供 参考 依据。
1 仪器、试药与样品
1.1 仪器 8453e型紫外可见分光光度计(美国agilent); p680a型高效液相色谱仪，带自动进样器、二极管阵列检测器及柱温箱(德国dionex);bp211d型 电子 分析天平(德国sartorius公司，0.01 mg);kq500型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司，功率500 w，频率40 khz)。
1.2 试药 柚皮苷对照品(批号：110722200309)购自 中国 药品生物制品检定所;野漆树苷对照品(自制，纯度≥98%);色谱甲醇(dima公司)，水为双蒸水，其余试剂均为分析纯。
1.3 样品 3批毛橘红药材均采自于广东省化州市，经广州中医药大学中药学院林励研究员鉴定，其原植物为化州柚citrus grandis ‘tomentosa’，样品来源见表1。表1 毛橘红样品
2 方法与结果
采用常温留样观察法，自2007年7月起，分别于第0、1、2、3、6、9、12个月取样品，测定其总黄酮、柚皮苷和野漆树苷含量。
2.1 总黄酮含量测定[2]
2.1.1 供试品溶液的制备[3] 取各样品粉末(过四号筛)0.05 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加石油醚(60～90 ℃)50 ml，超声提取45 min，弃去石油醚液，挥干样品中残存的石油醚，精密加甲醇50 ml，称定，超声提取30 min，取出，放凉，用甲醇补足减失的重量，过滤，即得。
2.1.2 柚皮苷对照品溶液的制备 精密称取经110 ℃干燥至恒重的柚皮苷对照品5.06 mg，置25 ml量瓶中，加甲醇溶解至刻度，摇匀，即得。
2.1.3 标准曲线的绘制 分别精密量取柚皮苷对照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 ml至25 ml量瓶中，然后分别加入10%硝酸铝溶液1 ml，加甲醇至刻度，摇匀，放置15 min。另取10%硝酸铝溶液1 ml置25 ml量瓶中，加甲醇至刻度，作为空白对照溶液，采用紫外分光光度法于306 nm处测定吸光度，以质量浓度(ρ)为横坐标，吸光度(a)为纵坐标，得回归方程为：a=34.846ρ+0.0435(r=0.999 1)，柚皮苷质量浓度在0.003 97～0.019 84 mg·ml-1范围内线性关系良好。
2.1.4 精密度试验 取柚皮苷对照品溶液，连续测定5次，吸光度rsd为0.22%，表明仪器精密度良好。
2.1.5 重复性试验 精密称取2号样品0.05 g，平行5份，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，测定总黄酮含量。结果显示，总黄酮含量的平均值为114.7 mg·g-1，rsd为0.78%，表明该方法的重复性较好。
2.1.6 稳定性试验 取1号供试品溶液，分别在0、15、30、45、60、90 min时测定总黄酮吸光度，结果其rsd为1.79%，表明供试品溶液在90 min内稳定性良好。
2.1.7 加样回收率试验 精密称取2号样品适量,平行5份，以加入法进行试验， 计算 回收率，结果见表2。表2 总黄酮加样回收率试验
2.1.8 样品含量测定 分别取在室温条件下贮藏0、1、2、3、6、9、12个月的3批毛橘红果样品，精密称定，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，依法测定，计算其总黄酮含量，结果见表5。
2.2 柚皮苷含量测定[3]
2.2.1 色谱条件 色谱柱：kromasilods柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相：甲醇水36%乙酸(体积比49∶51∶4)，流速：1.0 ml·min-1;柱温：室温;检测波长：283 nm。以柚皮苷计，理论塔板数应不低于2 500，见图1。
2.2.2 供试品溶液的制备 同“2.1.1”项下方法。
2.2.3 对照品溶液的制备 精密称取柚皮苷对照品5.06 mg于25 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
2.2.4 标准曲线的制备 分别精密吸取柚皮苷对照品溶液1.5、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 μl，进样，按“2.2.1”项下色谱条件进行测定，以柚皮苷进样量(x)为横坐标，峰面积(y)为纵坐标，绘制标准曲线。求得柚皮苷的回归方程为y=2.000×106x-4.012×104，r=0.999 9，柚皮苷进样量在0.303 6～2.024 0 μg范围内，与峰面积值呈良好的线性关系。
2.2.5 精密度试验 精密吸取柚皮苷对照品溶液2.0 μl，进样，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，平行5次，得柚皮苷峰面积rsd为0.25%。
2.2.6 重复性试验 精密称取2号样品5份，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，得柚皮苷含量平均值为58.7 mg·g-1，rsd=3.29%。
2.2.7 稳定性试验 取2号供试品溶液，分别于0、2、4、6、8 h进样，rsd=0.17%。表明供试品溶液在8 h内稳定性良好。
2.2.8 加样回收率试验 精密称取2号样品适量，平行5份，准确加入柚皮苷对照品溶液适量，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，测定柚皮苷含量，结果见表3。
2.2.9 样品含量测定 分别精密吸取“2.1.8”项下各供试品溶液10 μl，进样，依法测定，外标一点法 计算 柚皮苷含量，结果见表5。
2.3 野漆树苷含量测定[2]
2.3.1 色谱条件 色谱柱：kromasilods柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相：甲醇水乙酸(体积比49︰51︰1.5)，流速：1.0 ml·min-1;柱温：室温;检测波长：345 nm，以野漆树苷计，理论塔板数应不低于1 500，见图2。表3 柚皮苷加样回收率试验结果
2.3.3 对照品溶液的制备 取野漆树苷对照品1.9 mg，精密称定，置25 ml容量瓶中，加甲醇溶解稀释至刻度，再精密量取1.0 ml于5 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，制成0.015 2 mg·ml-1的对照品溶液。
2.3.4 标准曲线的制备 分别精密吸取野漆树苷对照品溶液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 μl,按“2.1.1”项下色谱条件进行测定，以野漆树苷进样量(x)为横坐标，峰面积(y)为纵坐标，绘制标准曲线。求得野漆树苷的回归方程为y=1.328×106x-1.839×103，野漆树苷进样量在0.015 2～0.182 4 μg范围内，与峰面积呈良好的线性关系。
2.3.5 精密度试验 精密吸取野漆树苷对照品溶液8.0 μl，进样，按“2.3.1”项下色谱条件进样测定，平行5次，得野漆树苷峰面积rsd为0.61%。
2.3.6 重复性试验 精密称取2号样品5份，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件进样测定，得野漆树苷含量平均值为7.30 mg·g-1，rsd=1.05%。
2.3.7 稳定性试验 取2号供试品溶液，分别于0、2、4、6、8 h进样，rsd=0.50%。表明供试品溶液野漆树苷在8 h内稳定性良好。
2.3.8 加样回收率试验 精密称取2号样品适量，平行5份，准确加入野漆树苷对照品溶液适量，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，测定野漆树苷含量，结果见表4。
2.3.9 样品含量测定 分别精密吸取“2.1.8”项下各供试品溶液10 μl，进样，依法测定，外标一点法计算野漆树苷含量，结果见表5。表4 野漆树苷加样回收率试验结果表5 3批样品中黄酮类物质含量变化
4 讨论
药物稳定性试验是评价药物内在质量的重要指标之一[4]，本实验研究了储存期对毛橘红黄酮类物质含量的影响，对毛橘红内在质量稳定性控制有一定的指导意义[5]。
结果表明，在1年的稳定性实验监测时限内，毛橘红黄酮类物质含量基本稳定。且总黄酮、柚皮苷和野漆树苷含量随着储存时间的增加有升高的趋势，提示在一定期限内，毛橘红原产地药农的“毛橘红越陈越好”的说法有一定的道理。实验暂定毛橘红药材的储存期为1年。
由于本实验样本数相对偏少，故需要在以后的实验中增加样本量，进一步验证毛橘红的储存期，从而 科学 制定出毛橘红药材的最佳储存期。
【 参考 文献 】
[1] 中华人民共和国卫生部药政管理局. 现代 实用本草(中册)[m].北京：人民卫生出版社,2000:103.
[2] 陈永刚,刘晓涵,林励,等.超声波提取法提取化橘红中黄酮类物质的工艺优选[j].中药材,2009,32(1):138-141.
[3] 陈永刚,林励,魏燕华,等.超声波提取法与索氏提取法提取化橘红柚皮苷的比较研究[j].中药新药与临床药理,2008,19(4):309-311.
[4] 国家药典委员会.中华人民共和国药典:2005年版二部[m].北京:化学 工业 出版社,2005，附录177.
[5] 符红波,陈美清,张奕鹏,等.胃舒散稳定性试验中橙皮昔含量的测定[j].广东药学院学报,2004,20(2):106,108.
