作者：范积平，张贞良，廖晓玲
【摘要】 目的 建立不同产地黄柏药材中4种主要生物碱类成分的含量测定方法。方法 采用高效液相色谱法，色谱柱为diamonsil c18(250 mm×4.6 mm, 5μm)，流动相为乙腈0.5%三乙胺(梯度洗脱)，流速为1.0 ml·min-1，柱温为25 ℃，检测波长为284 nm，同时测定黄柏药材中黄柏碱、药根碱、巴马汀和小檗碱的含量。结果 4种成分均能达到基线分离，线性良好。不同产地黄柏药材中4种主要生物碱类成分的含量差别较大，产自四川泸州黄柏中的黄柏碱、甘肃武都黄柏中的药根碱、广西桂林黄柏中的巴马汀、四川雅安黄柏中的小檗碱含量分别为最高。结论 本方法操作简便、结果准确、重现性好，适用于黄柏药材中4种主要生物碱类成分的含量测定。
【关键词】 高效液相色谱法;黄柏;生物碱;黄柏碱;药根碱;巴马汀;小檗碱;含量测定
abstract:objective to establish a simultaneous determination method for four main alkaloids in cortex phellodendri chinensis from different habitats by hplc. methods hplc was performed on diamonsil c18 column (250 mm×4.6 mm, 5 μm) with acetonitrile0.5% triethylamine as mobile phase (gradient elution) at a flow rate of 1.0 ml·min-1. the column temperature was maintained at 25 ℃ and the detective wavelength was set at 284 nm. the contents of phellodendrine, jatrorrhizine, palmatine and berberine were determined simultaneously.results all the four alkaloids achieved baseline separation with good linearity. the contents of the four main alkaloids in cortex p. chinensis from different habitats varied significantly. respectively, the contents of phellodendrine in cortex p. chinensis from luzhou of sichuan, jatrorrhizine in those from wudu of gansu, palmatine in those from guilin of guangxi, and berberine in those from yaan of sichuan were highest.conclusion this method is simple, reliable and repeatable, and is suitable for the determination of main alkaloids in cortex p. chinensis.
key words:hplc;cortex phellodendri chinensis; alkaloids; phellodendrine; jatrorrhizine; palmatine; berberine; determination
黄柏为常用中药，具有清热燥湿、泻火除蒸、解毒疗疮之功效，始载于《神农本草经》，原名“檗木”，列为上品，味苦，寒，无毒[1]，其后历代本草均有记载。wwW.11665.COm《 中国 药典》1963～2000年版均有收载，其来源有两种，即：关黄柏，芸香科植物黄檗(phellodendron amurense rupr.)的干燥树皮;川黄柏，芸香科植物黄皮树(phellodendron chinense schneid.)的干燥树皮[2]。《中国药典》2005年版将以上两种来源药材分别收载，列为两种药材，后者为通常所称的“黄柏”[3]。黄柏临床应用十分广泛， 现代 药 理学 研究表明其具有抗病原微生物、抗溃疡、降压、抗心律失常等作用[4]。黄柏中的主要活性部位为生物碱类化合物，包括小檗碱、巴马汀、药根碱和黄柏碱等主要成分[5]，其中小檗碱、巴马汀、药根碱为抗病原微生物的有效成分，药根碱有抗心律失常作用，而降压作用则与黄柏碱有关[4]。有报道采用高效液相色谱法测定黄柏中上述部分生物碱的含量[6～8]，但未见同时测定之报道。本文采用hplc法同时检测此4类生物碱成分的含量，测定并比较了12个不同产地的黄柏药材中的生物碱含量，为更好地控制黄柏药材及其制剂的质量提供了 参考 依据。
1 仪器与试药
1100型高效液相色谱仪，包括vwd检测器等(美国agilent公司);250 b型超声波清洗仪(江苏昆山市超声仪器有限公司);phs3c型ph计(上海雷磁仪器厂);cp225d型 电子 天平(德国sartorius公司)。盐酸小檗碱(批号7139906)、盐酸巴马汀(批号7329604)、盐酸药根碱(批号7339203)购自中国药品生物制品检定所，盐酸黄柏碱(经面积归一化法 计算 ，含量为98.6%，可作为含量测定用)购自天津马克生物技术有限公司。黄柏药材在四川、广西、重庆等地采集，采集时间为9～10月，经第二军医大学郑汉臣教授鉴定为芸香科植物黄皮树phellodendron chinense schneid.的干燥树皮。乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱为diamonsil c18柱(4.6 mm×250 mm, 5μm, dikma);流动相：乙腈(a)、0.5%三乙胺(磷酸调ph至2.5)(b)，梯度洗脱(0～10 min，15%a～28%a;10～18 min，28%a;18～20 min，28%a～15%a);流速：1.0 ml·min-1;运行时间：20 min;柱温：25 ℃;检测波长：284 nm;进样量：20 μl。
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品贮备液的制备 精密称取盐酸黄柏碱对照品10.51 mg、盐酸药根碱对照品5.04 mg、盐酸巴马汀对照品4.95 mg、盐酸小檗碱对照品20.75 mg，分别置4个10 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释到刻度，作为对照品贮备液。
2.2.2 混合对照品溶液的制备 取以上4种对照品贮备液适量，混合后分别取适量置6个容量瓶中，分别加入乙腈ph为2.5的磷酸(体积比1∶1)稀释成不同浓度的一系列混合对照品溶液，使所含黄柏碱的质量浓度分别为2.63、5.26、10.51、15.77、26.28、52.55 μg·ml-1;药根碱的质量浓度分别为0.63、1.26、2.52、3.78、6.30、12.60 μg·ml-1;巴马汀的质量浓度分别为0.62、1.24、2.48、3.71、6.19、12.38 g·ml-1;小檗碱的质量浓度分别为25.94、51.88、103.75、155.63、259.38、518.75 g·ml-1。
2.2.3 供试品溶液的制备 取本品粉末(过三号筛)约0.2 g，精密称定，置50 ml容量瓶中，加乙腈ph为2.5的磷酸(体积比1∶1)40 ml，超声处理60 min，放冷，用乙腈ph为2.5的磷酸(体积比1∶1)稀释至刻度，摇匀，滤过。取续滤液过0.45 μm微孔滤膜，即得。
2.3 系统适应性试验
精密吸取“2.2.2”项下混合对照品溶液(含黄柏碱52.55 g·ml-1、药根碱12.60 g·ml-1、巴马汀12.38 g·ml-1、小檗碱518.75 g·ml-1)20 μl，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图。黄柏碱、药根碱、巴马汀和小檗碱的保留时间分别为6.62、14.20、17.05、18.26 min。见图1。
2.4 线性关系考察
取“2.2.2”项下混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱图。以峰面积积分值(y)对进样量(x)进行线性回归， 计算 得回归方程。4种生物碱类成分的线性关系考察结果见表1。表1 4种生物碱类成分的线性关系考察结果
table 1 linear relations of 4 alkaloids (phellodendrine, jatrorrhizine, palmatine and berberine)
生物碱类成分回归方程相关系数(r)线性范围/ng黄柏碱y=21.37x-1.5640.999 752.55～1 051药根碱y=37.55x-2.1370.999 612.60～252.0巴马汀y=43.44x+2.5930.999 912.38～247.5小檗碱y=39.11x-1.3350.999 9518.8～10 375
2.5 精密度试验
取“2.2.2”项下混合对照品溶液(黄柏碱52.55 g·ml-1、药根碱12.60 g·ml-1、巴马汀12.38 g·ml-1、小檗碱518.75 g·ml-1)，重复进样6次，记录色谱图。结果黄柏碱、药根碱、巴马汀和小檗碱峰面积的rsd分别为0.72%、0.56%、0.37%、0.32%，表明仪器精密度良好。
2.6 重复性试验
精密称取同一批样品，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，平行操作6份，分别测定，记录色谱图。结果，黄柏碱、药根碱、巴马汀和小檗碱峰面积的rsd分别为1.22%、1.57%、1.07%、0.98%，表明本方法重复性良好。
2.7 稳定性试验
取上述供试品溶液，室温下放置，分别于0、1、2、4、8、12、24 h进样测定，记录色谱图。结果黄柏碱、药根碱、巴马汀和小檗碱峰面积的rsd分别为1.72%、2.05%、1.71%、1.27%，表明供试品溶液在室温条件下放置24 h稳定性良好。
2.8 加样回收率试验
精密称取已知含量的同一批黄柏药材粉末0.2 g，共6份，分别精密加入混合对照品溶液(黄柏碱52.55 g·ml-1、药根碱12.60 g·ml-1、巴马汀12.38 g·ml-1、小檗碱518.75 g·ml-1)适量，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，记录色谱图。结果黄柏碱、药根碱、巴马汀和小檗碱的平均加样回收率分别为97.6%(rsd=1.15%)、101.3%(rsd=1.38%)、100.7%(rsd=1.22%)、99.4%(rsd=0.78%)。
2.9 样品测定
取不同产地的黄柏药材样品，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，每个产地平行3份，计算含量。结果见表2。表2 样品中4种生物碱类成分的含量测定结果
3 讨论
3.1 根据 文献 报道[5]，生物碱类是黄柏药材的主要活性成分，其中小檗碱含量最大，因此检测小檗碱的含量一直是黄柏药材及其制剂质量控制的重要指标。然而，关黄柏、黄连及其它非法定药材如三颗针(radix berberidis)、十大功劳(folium mahonicum)等，均富含小檗碱。故仅以小檗碱含量评价黄柏药材及其制剂的质量，专属性有所欠缺。而黄柏碱是黄柏的特征性成分，另黄柏碱、药根碱、巴马汀各自有其药理作用。故在对黄柏药材及其制剂进行质量控制时，除小檗碱外同时增加黄柏碱、药根碱、巴马汀的检测，是为有效补充。同时对4者进行检测，也能更好地将黄柏与关黄柏加以区分。
3.2 在流动相的选择中，摸索了不同的流动相体系的分离效果。最终确定在水相中加入0.5%的三乙胺，并将ph值调至2.5，能将生物碱类成分在较短的时间内进行有效分离，并且改善了峰形。
3.3 在前期测定波长考察过程中，以文献[6,7,9]道的345 nm作为检测波长,发现此波长处药根碱、巴马汀、小檗碱检测灵敏度高，但黄柏碱的吸收很弱;以220 nm为检测波长时，黄柏碱有较强吸收，但前三者吸收变弱;而在284 nm波长处4种成分的检测灵敏度均较高，故选用284 nm为检测波长较为适宜。
3.4 本实验对来自不同产地黄柏药材中的4种主要活性成分同时进行了测定。结果，不同产地黄柏药材中4种主要生物碱类成分的含量差别较大，产自四川泸州黄柏中的黄柏碱、甘肃武都黄柏中的药根碱、广西桂林黄柏中的巴马汀、四川雅安黄柏中的小檗碱含量分别为最高。但不能仅以此结果简单地判断某地产的黄柏药材质量的优劣，因为黄柏药材中生物碱的含量与药材的采收期、原植物的生长年限等亦有关[10]，其影响如何，有待进一步研究。
【 参考 文献】
[1] 吴普,孙星衍.神农本草经[m].北京:人民卫生出版社,1982:43.
[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：2000年版一部[m].北京:化学 工业 出版社,2000:251-252.
[3] 国家药典委员会.中华人民共和国药典:2005年版一部[m].北京:化学工业出版社,2005:214-215.
[4] 肖培根.新编中药志(第3卷)[m].北京:化学工业出版社,2002:664-670.
[5] 龚千锋.中药炮制学[m].北京:
