作者：潘天玲，李坤平，林赞菲，黄碧玲
【摘要】 目的 测定13个不同产地布渣叶样品中总黄酮含量及其清除自由基活性。方法 采用al(no3)3nano2naoh体系比色法测定总黄酮含量，采用1,1二苯基2苦基肼自由基（dpph·）、羟自由基（·oh）和超氧自由基（o2-·）等模型测定布渣叶总黄酮清除自由基活性。结果 各产地总黄酮含量差异较大，其中以广西来宾样品含量最高，达到了55.22 mg·g-1，平均为27.06 mg·g-1。各产地总黄酮样品均具有清除dpph·活性，其自由基清除率随供试品总黄酮浓度的增大而提高，呈现一定的量效关系；但其清除·oh和o2-·活性与总黄酮浓度关系不明显。结论 不同产地布渣叶总黄酮含量差异较大；各产地布渣叶总黄酮均具有较好的自由基清除活性。
【关键词】 布渣叶；总黄酮；自由基；清除活性
abstract:objective to analyze the contents of total flavonoids in microcos paniculata l. from different habitats and the radicalscavenging activity of total flavonoids. methods contents of total flavonoids in the extracts were analyzed by spectrophotometry based on al(no3)3nano2naoh reaction system, and the radicalscavenging activity towards 1, 1diphenyl2picryhydrazyl （dpph·) radical, hydroxyl radical（·oh）and superoxide anion radical（o2-·）, were determined in vitro. results contents of total flavonoids in microcos paniculata l. varied with habitats and 55. 22 mg·g-1 was the highest. the average content was 27.06 mg·g-1. all the samples had radicalscavenging activity against dpph·, ·oh and o2-·. there was a clear doseeffect relationship between the radicalscavenging activity against dpph· and the concentration of flavonoids, but no this relationship was found when against·oh and o2-·. conclusion contents of total flavonoids in microcos paniculata l. varied with habitats, and all the plants have radicalscavenging activity.
key words:microcos paniculata l.；total flavoniods；radicalscavenging activity
自由基是生物体内化学性质极其活跃的物质，其大量存在会对生物膜、蛋白质、核酸等生物大分子造成危害。wWW.11665.Com研究表明，肿瘤、衰老、心脑血管等疾病的发生与其有着密切的联系［1,2］。黄酮类化合物是 自然 界广泛存在的一类天然产物，具有抗氧化、抗突变、抗衰老等多种生物活性，其自由基清除活性是当前的研究热点之一［1-3］。
布渣叶，椴树科植物破布树（microcos paniculata l.）的叶，主要分布于我国广东、广西、海南等地，富含黄酮类成分［4-7］，但未见有关其抗氧化和清除自由基活性的报道。本文对不同产地布渣叶总黄酮含量进行了分析，并选择了dpph·、·oh和o2-·等体外模型对其自由基清除活性进行了考察，旨在为其进一步的开发利用提供 科学 依据。
1 仪器与试药
数控超声波清洗机（kh400 kdb型，昆山禾创超声仪器有限公司，40 khz，320 w），re52aa旋转蒸发器（河南巩义英峪予华仪器公司），tu1810型紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）。
d101大孔吸附树脂（天津市海光化工有限公司）；芦丁（ 中国 药品生物制品鉴定所，批号：050923）；1,1二苯基2苦基肼（dpph，sigma公司）；氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝、乙醇、甲醇、水杨酸、双氧水、硫酸亚铁、三羟甲基氨基甲烷、邻苯三酚、盐酸均为市售分析纯。布渣叶，2008年7月～9月采自广东广州、阳江、化州、顺德、中山、沙坪、阳春、龙口、电白；广西来宾、玉林、武鸣；海南儋州等地，由广州中医药大学中药学院李卫民教授鉴定为椴树科植物破布树（microcos paniculata l.）的叶，干燥，粉碎，备用；药材存放在广东药学院制药工程教研室。
2 方 法
2.1 供试品溶液的制备［6，7］
精密称取不同产地布渣叶各2.500 g，加入体积分数70%乙醇50 ml，于30 ℃下超声提取2次，第1次30 min，第2次20 min；合并两次滤液，减压回收至无醇味，加水至100 ml，静置，过滤，将滤液倒入已放有10 g预处理好的d101树脂的锥形瓶中，振荡吸附12 h后过滤，分别用50 ml去离子水、30 ml体积分数20％乙醇和30 ml体积分数95％乙醇洗脱；收集体积分数95％乙醇洗脱液，减压蒸干后用甲醇溶解并定容至25 ml，即得。
2.2 标准曲线的制备［5］
精密称取120 ℃干燥至恒重的芦丁对照品10.2 mg，置50 ml容量瓶内，用体积分数70%乙醇溶解并稀释至刻度，即得芦丁对照品溶液。精确吸取0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.5、3.0 ml芦丁对照品溶液于10 ml量瓶中，分别补加体积分数70％乙醇至5 ml；然后顺次加入质量分数5%nano2溶液0.3 ml，放置6 min，质量分数10%al(no3)3溶液0.3 ml，放置6 min，质量分数4%naoh溶液4 ml，再加入体积分数70%乙醇溶液至刻度，摇匀，静置15 min后于510 nm处测定吸光度值。以吸光度a对芦丁质量（m）进行线性回归，得到回归方程：a=1.33175 m-0.00449（r=0.9989）。在0.0816～0.604 mg范围内，线性关系良好。
2．3 总黄酮含量的测定方法
取各待测样0.1ml，按上述标准曲线显色方法显色后在510 nm处测定吸光度值a，根据上述标准曲线方程 计算 总黄酮质量。
2.4 清除dpph·活性测定［1，2］
精密称取dpph 2.74 mg，用95％乙醇溶解并定容至100 ml。精密量取dpph溶液2 ml，加入 0.1 ml经适当稀释的供试品溶液，混匀，30 min后于517 nm波长处测定其吸光度值，以(1)式计算清除率。
e(%)=a0－ata0×100%(1)
式中，e:清除率；a0：初始dpph溶液的吸光度；at：加入供试品溶液30 min后 dpph溶液吸光度。
2.5 清除·oh活性测定
利用fenton反应进行测定［2,8］，标准反应体系中含9.8 mmol/l h2o2 2 ml，9 mmol/l feso4 2 ml,9 mmol/l水杨酸乙醇溶液2 ml，供试品溶液2 ml；以h2o2启动反应，37 ℃反应30 min后在510 nm波长处测吸光度值，以(2)式 计算 清除率。
e(%)=as－aba0-ab×100%(2)
式中e：清除率；a0：不加h2o2反应体系吸光度；as：标准反应体系吸光度；ab：不加供试品反应体系吸光度。
2.6 清除o2-·活性测定
采用邻苯三酚自氧化法［2,8］，取trishcl缓冲溶液（0.05 mol/l，ph 8.2）4.5 ml，供试品溶液0.1 ml，混匀，加入2.5 mmol/l邻苯三酚溶液0.4 ml,摇匀后于25 ℃恒温水浴反应4 min，最后加入2滴盐酸（8 mol/l）终止反应，测定溶液在320 nm波长处的吸光度值，以(3)式计算清除率。
e(%)=a0－(as－ab)a0×100%(3)
式中e：清除率；a0：不加样品时反应体系的吸光度；as：标准反应体系吸光度；ab：不加邻苯三酚溶液反应体系吸光度。
3 结果与分析
13个不同产地布渣叶总黄酮及其总黄酮清除dpph·、·oh和o2-·自由基活性分析结果见表1。表1 不同产地布渣叶总黄酮及其总黄酮自由基清除活性结果（略）
由表1可见，各产地布渣叶药材总黄酮含量差异较大，其中以广西来宾样品含量最高，达到了55.22 mg·g-1，广东电白样品总黄酮含量最低，仅为10.76 mg·g-1；不同产地样品平均总黄酮含量为27.06 mg·g-1。
13个样品均具有一定的清除dpph·的能力，且其自由基清除率随供试品总黄酮浓度的增大而提高，呈现一定的量效关系，其清除率（y）和总黄酮浓度（c）的关系可以表达为y=1.194 c+7.298（r =0.966）。
同样，13个样品产地的布渣叶样品均具有一定的清除·oh 和o2-·的能力，但其量效关系不明显，平均清除率分别为（28.925±4.626）%和（44.5±19.147）%。整体上，对·oh清除效果较稳定但清除率较低，对o2-·大部分样品清除率较高，但不同产地布渣叶总黄酮样品清除率差异较大，这可能与总黄酮样品中具体的组分不同有较大关系，具体因素还有待进一步探讨。
4 讨 论
4.1 不同产地布渣叶因种源遗传性状、生长的地理环境、采收季节等因素不同导致其总黄酮含量各异是正常的。从上述分析结果来看，布渣叶药材的总黄酮含量可以作为其质量控制指标，但此次研究选择样本量较少，且未能考虑其采收时间等因素的影响，其总黄酮平均含量27.06 mg·g-1仅可作为药材质量控制的 参考 依据。
4.2 由13个不同产地布渣叶总黄酮自由基清除率的测定结果可知，布渣叶总黄酮具有清除dpph·、·oh和o2-·自由基活性，是一种值得开发的自由基清除剂，其构效关系尚需进一步研究。
致谢：感谢广东药学院黄纪云、简银彩、张樱丰等同学，广西大学陈丛谨老师和海南大学陈致水老师在研究过程中给予的帮助。
【参考 文献 】
［1］alothman m, rajeev bhat a a. karim antioxidant capacity and phenolic content of selected tropical fruits from malaysia extracted with different solvents［j］.food chem，2009,115(3):785-788.
［2］li haiyun, hao zaibin, wang xiuli, et al. antioxidant activities of extracts and fractions from lysimachia foenumgraecum hance［j］.bioresource technol,2009,100 (2):970-974.
［3］havsteen b h.the biochemistry and medical significance of the flavonoids［j］.pharmacol therapeut,2002，96:77-80.
［4］张丽萍,罗集鹏.布渣叶的药学研究与临床应用概述［j］.中药材,2008,31(6):271-272.
［5］潘天玲,李坤平,贲永光,等.正交试验法优化布渣叶总黄酮提取工艺的研究［j］.广东药学院学报,2008,24(5):454-456.
［6］李坤平,贲永光,李卫民,等.大孔吸附树脂对布渣叶总黄酮的富集纯化特性研究［j］.广东药学院学报,2008,24(6):539-542.
［7］李坤平,潘天玲,高崇凯,等.大孔吸附树脂富集纯化布渣叶总黄酮的研究［j］.中药材,2009,32(4):601-603.
［8］梁丽丽,曹光群,曾兰兰,等.中药地榆提取物对自由基的清除作用［j］.天然产物研究与开发,2008,20（3):511-513.
