【摘要】 目的 探索用issr分子标记方法在核酸分子水平上鉴别道地药材化橘红。方法 从20条issr引物中筛选合适的引物对化橘红、橘子、柚子等共16个样品进行pcr扩增及电泳分析，寻找特征位点。 结果 有2条issr引物扩增出较为明显的多态性特征条带，可单独或联合应用鉴别化橘红。结论 issr作为一种简便、可靠的分子标记方法，可用于化橘红的鉴别。
【关键词】 化橘红；issr；分子标记技术
abstract:objective to identify exocarpium citri grandis by inter-simple sequence repeat markers. methods primers suitable for routine analysis were screened from 20 intersimple sequence repeat primers, then, they were used in pcr and sepharose electrophoresis of 16 samples of exocarpium citri grandis, citrus reticulata and citrus grandis（linn.）osbeck.results two of the 20 primers amplified polymophic bands and suitable for the identification of exocarpium citri grandis. conclusion intersimple sequence repeat markers provide a quick, reliable molecular marker for identification of exocarpium citri grandis.
key words:exocarpium citri grandis; intersimple sequence repeat; identification
化橘红（exocarpium citri grandis）是芸香科植物柚citrus grandis (l.) osbeck的未成熟或近成熟的干燥外层果皮，通称柚皮橘红、化州橘红、柚子皮。WWw.11665.CoM柚的栽培变种化州柚citrus grandis “tomentosa”的外层果皮同作化橘红入药。药材呈对折的七角或展开的五角星状，单片呈柳叶形，气芳香，味苦、微辛，具有散寒，燥湿，利气，消痰等功效。主产于广东、广西、四川、湖南、湖北、浙江，其中以广东化州产最为道地。
利用issr（intersimple sequence repeat，简单序列重复区间）分析是基于pcr的分子标记技术，最早由zietkiewicz等［1］于1994年提出，由于其操作简单，专属性强，重现性好，现已广泛用于动植物及微生物的多态性分析、遗传结构、种群分类和中药材的分类鉴别等方面。
本文探索利用issr方法选择合适的引物对道地药材化橘红及相近品种橘子、柚子进行分析和鉴定，试图在dna分子水平上对其差异性进行研究。
1 材料、试剂与仪器
1.1 材料
共采集化橘红药材干品4批以及新鲜果实6批，均由化州中药厂提供，编号分别为h1～h10（其中h1～h4为干品，h5～h10为新鲜品），经广东省药检所中药室林惠蓉主任药师鉴定为芸香科植物化橘红exocarpium citri grandis。作为易混用品进行比较分析，另采集新鲜橘子皮2批（高州产，编号j1、j2，经广东省药检所中药室莫结丽副主任药师鉴定为芸香科柑桔属citrus reticulata）、柚子皮4批［梅州产编号y1，广西产编号y2、y3，海南产编号y4，经广东省药检所莫结丽副主任药师鉴定为芸香科植物citrus grandis (linn.)osbeck］，共计16批样本。
1.2 试剂
tris、β巯基乙醇购自sigma公司；pcr buffer、mg2+、taq dna聚合酶、dntps购自广州威佳生物技术有限公司及宝生物有限公司；超纯水、dgl 2000 dna marke购自北京鼎国生物公司；琼脂糖购自广州宝泰克生物科技有限公司；issr引物由上海生工生物技术服务公司合成。其余试剂均为国产分析纯试剂。
1.2.1 总dna提取液
三水合乙酸钠6.8 g，十二烷基磺酸钠7 g，聚乙烯基吡咯烷酮10 g，乙二胺四乙酸二钠 9.3 g，氯化钠14.6 g，加水定容至500 ml，用naoh（1 mol/l）调ph至5.5，灭菌备用。
1.2.2 kac溶液(2.5 mol/l，ph 4.8)
取醋酸钾122.7 g，加水定容至500 ml，用冰醋酸调ph至4.8，灭菌备用。
1.2.3 1×te缓冲液
取tris（1 mol/l）1 ml， edta（0.5 mol/l）0.2 ml，加水定容至100 ml。
1.3 仪器
eppendorf minispin 离心机（德国eppendorf 公司）； 9700型pcr仪（美国abi公司）； power300型电泳仪（美国biorad公司）； ultrospec 2000紫外分光光度计（美国安玛西亚公司）；universal hoodii 凝胶成像系统（美国biorad公司）。
2 方法与结果
2.1 实验方法
2.1.1 样品总dna的提取
采用zigenhagen法［2-4］，取样品约0.5 g，置液氮中研磨成细粉，转移至1.5 ml离心管中，立即加入预冷至-20 ℃的丙酮1 ml，振摇约5 min，9000 r/min离心6 min；弃上清液，加入预热至65 ℃的总dna提取液1 ml，置65 ℃水浴中1 h，期间不时振摇，取出，9000 r/min离心5 min；取上清液，加0.5 ml苯酚异戊醇（ 体积比24∶1），混匀，至冰浴中放置10 min，期间不时振摇，取出，15000 r/min离心6 min；取上清液，加入2/3体积的kac溶液（2.5 mol/l，ph4.8），混匀，冰浴20 min，15 000 r/min离心10 min；取上清液，加入2/3体积的kac溶液（2.5 mol/l，ph4.8）同上操作， 重复1次； 取上清液， 加入2/3体积的预冷至-20 ℃异丙醇，混匀，置-20 ℃放置30 min，6000 r/min离心6 min；弃上清液，沉淀分别加入体积分数70%乙醇和无水乙醇0.5 ml洗涤，弃乙醇， 自然 干燥后，加1×te缓冲液（含1 μg/ml rnase a）40 μl置37 ℃水浴溶解，经紫外分光光度计测定浓度后用1×te缓冲液稀释样品总dna浓度到50 ng/μl，作为pcr扩增模板。
2.1.2 issrpcr扩增
issr引物序列参照加拿大british columbia大学生物技术实验室（编号ubc issr801-900），通过筛选选择20条引物进行实验。
pcr反应体系为20 μl：超纯水14.4 μl，10×pcr buffer 2.0 μl，mgcl2(20 mmol/l)1.5 μl，dntp(10 mmol/l)0.4 μl，引物(0.011 mmol/l)0.5 μl，模板（50 ng/μl）1.0μl，taq酶(5 u/μl)0.2 μl。
pcr扩增程序为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性40 s，53 ℃退火35 s，72 ℃延伸70 s，40个循环，72 ℃保持5 min，扩增产物4 ℃保存。表1 选取的issr引物（略）注：r=(a,g)，y=(c,t)，h=(a,c,t)(i.e.not g)，v=(a,c,g)(i.e. not t)
2.1.3 电泳分析
issrpcr产物使用1.8 %的琼脂糖凝胶电泳检测（电泳后凝胶用eb染色），以dgl 2000 dna marker定位, 3.5 v/cm恒压电泳，凝胶成像扫描。
2.2 结果
样本提取dna 多为白色，部分干品dna为浅褐色，溶解后经紫外分光光度检测，a260/a280比值均在1.6～2.0之间， 计算 dna浓度范围250～3000 ng/μl，干品浓度稍低，所有dna样品均质量较好，可以用于后续实验。
在20个issr引物扩增产物的电泳结果中，大部分产物电泳条带均表现出了共有的条带，同时样品间也出现了 规律 性不强的多态性条带，只有引物ubc814（图1）和ubc880（图2）扩增的结果表明不同品种的条带有所区别，所有的化橘红均出现了区别于橘子和柚子的特征条带。ubc814的特征条带主要分布在约250 bp、750 bp和1 200 bp位置，而ubc880的特征条带主要分布在约350 bp、750 bp和1 000 bp位置。单独或联合应用这两条issr引物对化橘红进行分析即可达到辨别鉴定的目的。
3 讨 论
issr分子标记技术因操作简单、重现性好［5］而已经广泛应用于植物品种包括中药材如白术［6］、益母草［7］、栀子［8］、党参［9，10］等的遗传关系和遗传多样性等方面的研究，也有直接用于中药材如石斛的鉴别［11］。本研究尝试利用issr方法对道地药材化橘红进行分子标记鉴别分析。化橘红药材均为干品，但考虑到作为比对用的易混用品均为新鲜样本，为考察化橘红药材干品和鲜品是否存在差别，因此本研究也选用了新鲜化橘红果皮样本进行分析。
在实验过程中发现化橘红样品总dna提取的纯度和浓度对实验结果有直接的影响。化橘红及其相近品种的果皮由于含有较多的脂溶性物质及多糖类物质，而遗传物质较少，特别是干品，由于氧化降解造成次生产物较多，dna也受到部分破坏和损失，因此提取总dna的难度较高。本实验尝试使用商品化的基因组提纯试剂盒对样本总dna进行提取，结果表明由于受到回收容量的限制以及样本dna含量较低因素的影响，新鲜品单次提取的dna量不足以满足后续的多次分析要求，而干品纯度则基本不能达到实验要求。此外，本实验还尝试了采用改进的ctab法［12，13］提取，新鲜样本提取的效果较好，但干品效果仍不理想，提取产物基本为半液态的褐色油脂状物质，纯度无法达到分析要求。改用zigenhagen法后，新鲜品和干品提取效果均得到很大改善，dna纯度明显提高，虽然部分干品样本提取后的dna呈浅褐色，但a260/a280比值均都在1.6～2.0，dna浓度250～3 000 ng/μl，符合分析所需的要求。
实验结果显示化橘红干品与新鲜品的某些issr扩增条带有明显差别，表明化橘红药材干品的dna确实受到了较大的损伤，影响了一部分结果的分析判断。
本实验选用了20条issr引物进行分析鉴别，但最终只有2条引物能达到种间的鉴定，而其余引物扩增的条带均不同程度出现均一化，多态性不够明显，表明化橘红、橘子以及柚子的issr序列有着较高的同源性，序列在进化过程中趋向保守，也有可能说明了不同种群间曾发生过 自然 的或人为的交错，提示化橘红道地性已有所减弱。
【 参考 文献 】
［1］zietkiewicz e,rafalski a,labuda d. genomic fingerprinting by simple sequence repeat (ssranchored polymerase chain reaction amplification)［j］. genomics,1994,20:176-183.
［2］pierre g, haurence m d. isolation of plant dna:a fast, inexpensive and reliable method［j］. plant mol biol rep,1992,10:60-65.
［3］邹喻苹，汪小全，雷一丁,等. 几种濒危植物及其近缘类群总dna的提取与鉴定［j］. 植物学报，1994, 36 (7): 528-533.
［4］应站明，李媛. 改良zigenhagen法提取南方红豆杉总dna［j］. 萍乡高等专 科学 校学报，2007，3(6): 64-66.
［5］王建波. issr分子标记及其在植物遗传学研究中的应用［j］. 遗传，2002，24(5): 613-616.
［6］刘逸慧，陈斌龙，周晓龙,等. 药用植物白术栽培群体的遗传多样性研究［j］.
