作者：卢秀霞 龙晓英 丁钢 袁飞 陈金爱 陈秋伟 张海龙
【摘要】 目的 研究辣椒碱纳米乳注射剂的处方和制备工艺，并对其质量进行评价。方法 以外观、粒径、包封率为指标，通过单因素试验筛选处方成分，包括油相、乳化剂、助乳化剂组成及比例，同时优化制备工艺。结果 优选得辣椒碱纳米乳处方组成为：中链脂肪酸三甘油酯∶吐温80∶豆磷脂∶丙二醇的质量比为1.5∶2.5∶1.25∶1.5;所制得纳米乳滴平均粒径6.16 nm，多分散系数0.307，包封率85.22％。结论 制得的辣椒碱纳米乳制备工艺简单，并符合纳米乳主要指标要求。
【关键词】 辣椒碱 纳米乳 粒径 含量测定 包封率
辣椒碱（capsaicin）是辣椒辛辣物质和具有药物活性的主要成分［1］。纯辣椒碱为白色针状晶体，熔点65～66 ℃；易溶于甲醇、乙醇、三氯甲烷、乙酸乙酯等有机溶剂及碱性水溶液，但难溶于水。
辣椒碱通过选择性拮抗神经肽p物质，减少炎性介质组胺、缓释肽和前列腺素生成、释放而发挥抗炎镇痛效果［2］，有效 治疗 带状疱疹后遗症神经痛、糖尿病神经痛、面部神经痛、风湿性关节炎和骨关节炎等疼痛，是新型非成瘾性镇痛药［3］。wwW.11665.cOm由于疗效肯定，美国药典24版已经收载。目前，市场上辣椒碱产品主要是皮肤局部用制剂［46］，起效慢、药物吸收不完全，且对皮肤刺激性大，病人顺应性较差。
纳米乳（nanoemulsion）是粒径为10～100 nm的乳滴分散在另一种液体中形成的胶体分散系统，属热力学稳定体系［7］。作为一种新型给药系统，纳米乳不良反应小、安全性高，对难溶性药物有较强增溶能力，有效提高药物的生物利用度而受到极大关注［8-11］。因此，本文将辣椒碱制成纳米乳注射剂，以增加辣椒碱的溶解度，减少刺激性，同时通过控制粒径（＜100 nm），避免网状内皮单核细胞吞噬系统（mps）吞噬而延长辣椒碱体内作用时间，改善辣椒碱生物学性质，最终达到起效快、镇痛时间长、副作用低的目的，为扩大辣椒碱临床应用提供依据。
1 仪器与试药
1.1 仪器
jb2型恒温磁力搅拌器（上海智光仪器仪表有限公司），十万分之一 电子 分析天平（bp211d，德国赛多利斯），f4500 hitachi 荧光分光光度计（日本日立公司），zetasizer nano zs 90纳米粒度及zeta电位分析仪（英国malvern instruments ltd），jelioocxⅱ透射电镜(日本)，shimadzu lc10a 高效液相色谱仪（日本岛津公司），shimadzu rf10axl荧光检测器（日本岛津公司）。
1.2 试药
辣椒碱原料（贵州安顺生达生物科技开发公司，纯度≥97%，批号20030503），辣椒碱对照品（sigma 公司，纯度≥97％，批号2069698），中链脂肪酸三甘油酯（mct，德国 sasol germany gmbh，iv 级，批号061224），吐温80（上海申宇医药有限公司，药用级，批号080201），豆磷脂（上海金伴药业有限公司，药用级，批号021109），葡聚糖sephadexg50（北京拜尔迪生物公司，批号17004302），丙二醇（天津市富宇精细化工有限公司，批号071012），色谱甲醇（天津四友化学试剂厂），超纯水，其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 纳米乳处方筛选
2.1.1 纳米乳的制备 称取适量的药物、油、乳化剂、助乳化剂，搅拌混匀，50 ℃水浴加热溶解，得均匀透明的溶液；在磁力搅拌下将此溶液逐滴加入60～65 ℃蒸馏水中乳化。
2.1.2 油、表面活性剂种类 分别以大豆油、mct、油酸乙酯为油相，吐温80、泊洛沙姆f68、豆磷脂为乳化剂，考察外观及700 nm透光率（此波长药物、辅料自身无吸收，透光率仅与乳滴大小成反比），初步筛选乳剂的组成，结果见表1。结果表明：乳化剂与油的质量比为4∶1时，乳化剂的乳化能力由强到弱排列是：吐温80＞泊洛沙姆f68＞豆磷脂，故选择吐温80为乳化剂；油相被乳化由强到弱排列是：油酸乙酯≈mct＞大豆油，而mct已被欧洲药典准许用于注射剂，且已有上市产品［12］436-439，故选择mct为油相。
表1 油相、表面活性剂种类对粒径的影响（略）
table 1 effect of oil phase and surfactants on particle size
2.1.3 表面活性剂用量 吐温80与mct按不同质量比，分别以4∶1、3∶1、2.5∶1、2∶1、1∶1混合，按“2.1.1”项制备，考察外观及700 nm透光率，结果见表2。结果表明：在mct与丙二醇的量、制备工艺相同前提下，吐温80∶mct≥2.5∶1时能形成微乳。因此，选择吐温80∶mct=2.5∶1作为表面活性剂与油最低比例。
2.1.4 复合乳化剂比例 固定（吐温80+豆磷脂）∶mct=2.5∶1，将吐温80与豆磷脂按不同质量比混合，考察方法同“2.1.3”项，结果见表3。结果表明：当吐温80∶豆磷脂≥2∶1时能形成微乳。为减少吐温80的用量，选择吐温80∶豆磷脂=2∶1为复合乳化剂比例。
2.1.5 油浓度 固定吐温80∶豆磷脂∶mct=0. 25∶0.125∶0.15，按“2.1.1”项制备，考察mct不同浓度时的包封率。由表4可见，辣椒碱纳米乳包封率随mct浓度的增大而相应提高，当mct浓度上升至1.50%，包封率为85.22%，符合药典的相关规定（包封率＞80%）。
2.2 纳米乳制备工艺优化
2.2.1 乳化温度选择 将药物、油、复合乳化剂、助乳化剂按处方量混匀，50 ℃水浴加热溶解，得均匀透明的溶液，在磁力搅拌下将此溶液分别逐滴加入60～65 ℃与常温（25 ℃）蒸馏水中乳化30 min。辣椒碱纳米乳包封率结果见表5。结果表明：60～65 ℃乳化的包封率略高于常温乳化。为简化生产工艺，选择常温（25 ℃）乳化。
表2 油与表面活性剂比例对粒径的影响（略）
table 2 effect of the proportion between oil and surfactants on particle size
表3 复合乳化剂比例对粒径的影响（略）
table 3 effect of the proportion of composite emulsifiers on particle size
表4 油浓度对辣椒碱纳米乳包封率的影响（略）
table 4 effect of oil concentration on entrapment efficiency of capsaicin nanoemulsion
2.2.2 油、水滴加顺序 将药物、油、复合乳化剂、助乳化剂按“2.2.1”项制备均匀透明的溶液，在磁力搅拌下，分别将此溶液逐滴加入25 ℃蒸馏水中，以及将25 ℃蒸馏水一次倾入该溶液中乳化30 min，包封率结果见表6。结果表明：油、水滴加顺序对包封率影响不大。考虑今后 工业 生产更简单，选择蒸馏水一次倾入油中乳化的方式。
表5 温度对辣椒碱纳米乳包封率影响（略）
table 5 effect of temperature on entrapment efficiency of capsaicin nanoemulsion
表6 制备工艺对辣椒碱纳米乳包封率影响（略）
table 6 effect of preparation technology on entrapmentefficiency of capsaicin nanoemulsion
2.3 辣椒碱纳米乳注射剂的制备
依据辣椒碱纳米乳处方设计与工艺研究结果，结合注射剂的制备工艺，拟定辣椒碱纳米乳注射剂制备工艺如下：按处方量称取辣椒碱、油、乳化剂、助乳化剂，50 ℃水浴加热溶解，得均匀透明的溶液；在磁力搅拌下，将常温蒸馏水（0.22 μm滤过灭菌）倾入该溶液乳化30 min，形成淡黄色、澄清透明的辣椒碱纳米乳。于洁净环境下，0.22 μm微孔滤膜过滤辣椒碱纳米乳，将续滤液灌装在已灭菌的2 ml、5 ml安瓿中，拉封。将灌封好的辣椒碱纳米乳注射剂121 ℃、0.1 mpa热压灭菌15 min，即得。
2.4 形态与粒径测定
2.4.1 形态测定 取适量辣椒碱纳米乳，滴在覆有支持膜的铜网上，静止10 min后用滤纸片吸干，滴加1～3％磷钨酸溶液于铜网上负染5 min， 自然 挥干，用透射电子显微镜观察并拍摄照片，结果见图1。结果表明:纳米乳剂中的乳滴呈类球形，粒径分布均匀。
图1 辣椒碱纳米乳透射电镜照片(×50 000)（略）
figure 1 transmission electron photograph of capsaicin nanoemulsion(×50 000)
2.4.2 粒径大小与分布测定 取辣椒碱纳米乳适量，采用动态光散射（dynamic light scattering,dls）原理的nicomp380/zls激光粒度/动电位分析仪测定，其粒径与粒度分布见图2。结果表明：辣椒碱纳米乳的平均粒径6.16 nm，多分散系数0.307，粒度分布均匀。
图2 辣椒碱纳米乳粒径分布图（略）
figure 2 particle size distribution of capsaicin nanoemulsion
2.5 动电位测定
采用电泳光散射（electrophoretic light scattering,els）法，取辣椒碱纳米乳适量，室温下置nicomp380/zls激光粒度/动电位分析仪测定，动电位分布见图3。结果表明，所得辣椒碱纳米乳电位(ζ)平均值为－34.0 mv。
2.6 ph值测定
测定3批辣椒碱纳米乳的ph值，每批测定3次，取平均值。3批乳剂的ph值分别为5.45、5. 43、5.45，符合静脉注射剂对ph值的要求。
图3 辣椒碱纳米乳动电位分布图
figure 2 zeta potential microscope distribution of capsaicin nanoemulsion
2.7 辣椒碱纳米乳含量测定
2.7.1 色谱条件与系统适应性试验 色谱柱为diamonsil c18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇水磷酸（体积比70∶30∶0.1）；荧光检测波长为λex=283 nm,λem=310 nm；流速为1. 0 ml·min-1；进样量为20 μl。辣椒碱保留时间12.3 min，理论塔板数4 156，拖尾因子1.13，峰形对称，色谱图见图4a。
2.7.2 样品溶液的制备 精密称取0.10 mg辣椒碱对照品，无水乙醇溶解并定容至10 ml，取该液1. 0 ml，无水乙醇稀释至10 ml，摇匀，制得1.0 μg/ml辣椒碱对照液。精密量取0.004%辣椒碱纳米乳0. 30 ml（约相当于辣椒碱12 μg），无水乙醇溶解并定容至10 ml，超声混匀，制得1.2 μg/ml辣椒碱供试液。精密量取不含辣椒碱的空白纳米乳0.30 ml，同法制得阴性对照液。
2.7.3 方法专属性考察 分别量取对照液、供试液及阴性对照液20 μl，按上述色谱条件测定，结果表明，空白基质无干扰，且供试液与对照液保留时间基本一致，见图4。
图4 3种样品溶液荧光hplc图（略）
figure 4 fluorescencehplc of three samples
2.7.4 标准曲线绘制 精密称取辣椒碱对照品0. 20 mg于10 ml容量瓶中，无水乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，得20 μg/ml辣椒碱标准储备液。精密吸取该储备液0.1、0.3、0.4、0.5、1.0、2.0、3.0 ml置10 ml容量瓶中，无水乙醇稀释至刻度，摇匀，制得系列浓度对照液。分别进样20 μl，按上述色谱条件测定，以对照液质量浓度（ρ）为横坐标，峰面积（a）为纵坐标， 计算 回归方程为：a=4×106ρ-224614，r=0.999 7，结果表明辣椒碱在0.20～6.00 μg/ml范围内与峰面积线性关系良好。以信噪比（s/n）＝3计算，测得辣椒碱最低检测限为0.1 ng。
2.7.5 精密度试验 取 0.1 μg/ml辣椒碱对照液，连续进样5次，测得平均峰面积为10 012 711，rsd为0.54%，表明仪器精密度良好。
2.7.6 重现性试验 按上述方法制备浓度为0.8、1.0、2.0、4.0、6.0 μg/ml的辣椒碱供试液，各3份，以1. 0 μg/ml辣椒碱对照液的峰面积定量，结果各浓度辣椒碱含量平均值为91.10%、94.94%、91. 03%、91.01%、90.04%；rsd（n=3）为0.37%、0.85%、0.25%、0.42%、1.7%，表明本方法重现性良好。
2.7.7 稳定性试验 取供试液适量，分别于室温放置0、2、4、6、8、12、24 h后按色谱条件测定，测得峰面积日内rsd为0.32%（n=7），表明供试液在24 h内稳定。每天测1次，连续测5 d，峰面积日间rsd为1.5%（n=5）。
2.7.8 回收率试验 精密量取0.50 ml空白纳米乳15份，分3组，置10 ml容量瓶中，分别加入20 μg/ml辣椒碱标准储备液0.40、0.50、1.00 ml，各5份，无水乙醇定容，超声混匀，0.45 μm滤过，精密吸取续滤液20 μl按上述色谱条件测定，外标法计算回收率。结果高、中、低浓度平均回收率分别为100.14%、102.56%、107.25%，rsd值分别为1. 30%、0.83%、0.58%（n＝5），见表7。
2.7.9 含量测定 精密量取0.004%辣椒碱纳米乳0.50 ml，无水乙醇溶解并定容至10 ml，超声混匀，得辣椒碱供试液；另精密称取辣椒碱对照品适量，无水乙醇配成2.0 μg/ml辣椒碱对照液。分别吸取辣椒碱供试液、对照液20 μl，按上述色谱条件测定，外标法计算含量。结果3个批号辣椒碱含量分别为94.50%、94.55%和94.10%。
表7 辣椒碱纳米乳回收率（略）
table 7 recovery of capsaicin nanoemulsion
2.8 辣椒碱纳米乳包封率测定
包封率测定方法参照 文献 ［13］:量取0.004%辣椒碱纳米乳0.3 ml滴到葡聚糖凝胶柱中心，2 000 r/min离心5 min，洗脱液用无水乙醇溶解并定容至10 ml，超声混匀，按“2.7.1”项色谱条件测定，将峰面积代入标准曲线计算药物浓度。根据式1-1计算辣椒碱纳米乳的包封率。
包封率＝（ρ包封/ρ总药）×100% （1-1）
式中ρ总药表示辣椒碱总质量浓度，ρ包封表示纳米乳中被包封辣椒碱质量浓度。测得3批辣椒碱纳米乳的包封率分别为85.83%、84.50%、85.34%，rsd为0.79%。见表8。
表8 辣椒碱纳米乳包封率（略）
table 8 entrapment efficiency of capsaicin nanoemulsion
3 讨论
3.1 影响乳滴粒径因素
3.1.1 油、表面活性剂种类 油、表面活性剂种类是影响乳滴粒径的重要因素。根据纳米乳形成机理，当表面活性剂的亲水亲油平衡值（hlb）与油所需hlb值相当时，形成纳米乳较稳定［14］。当油、表面活性剂浓度不变，分别以大豆油、油酸乙酯、mct为油相，形成乳滴粒径由小到大排列：吐温80＜泊洛沙姆f68＜豆磷脂。可见，乳化剂乳化能力由强到弱排列：吐温80＞泊洛沙姆f68＞豆磷脂。同时，表3结果也表明，乳滴粒径随吐温80增加、豆磷脂减少而逐渐减小，说明吐温80乳化能力较强。制备o/w型乳剂，所需乳化剂的hlb值在8～16范围内，吐温80的hlb值为15.0；而豆磷脂仅3. 0，脂溶性过强，在水相体系中分散性较差，难以在油水两相中很好的分配；相反，泊洛沙姆f68的hlb值为29.0［12］516-519，亲水性强，不能在油水界面大量吸附，也难以形成牢固的界面膜，故乳化能力均较差。
油的种类同样影响微乳的形成。如表1所示，吐温80作乳化剂，油酸乙酯或mct为油相时均能形成透明微乳，而大豆油不能，这可能与大豆油为长链植物油，较难乳化有关。依据文献［15～18］报道，油相分子的大小以及碳链的长短影响微乳的形成：油相分子体积越小，对药物的溶解能力越强；碳氢链越短的油越能嵌入表面活性剂中形成界面膜，所得微乳相图区域越大。反之，碳氢链过长的油则不易形成微乳。因此，油酸乙酯、mct较大豆油易乳化。
3.1.2 表面活性剂用量 当油、表面活性剂种类固定时，表面活性剂用量显著影响乳滴粒径的大小。如表2所示，吐温80∶mct的质量比由1∶1增大到4∶1时，透光率由0.5%增大到99.6%，可见乳滴粒径随表面活性剂用量增大而减小。文献［19］也说明，纳米乳中乳化剂的用量为油量的20%～30%，而普通乳中乳化剂多低于油量的10%。这是因为纳米乳乳滴小界面积大，表面能高，需要浓度更高的乳化剂才能有效降低表面能，形成纳米乳。但考虑到毒性，在形成纳米乳前提下表面活性剂的用量应尽可能少。
3. 2 影响包封率因素
除了油的种类影响乳滴粒径以外，油的浓度是影响纳米乳包封率的关键因素。当mct由0.15 g增大到1.50 g时，包封率由20.07%提高到85. 22%。这是因为当辣椒碱浓度不变时，增大油的量，乳化剂、助乳化剂按比例增加，药质比随之提高，使更多药物溶解在油、乳化剂、助乳化剂组成的均相中，形成均匀透明的溶液；遇水乳化后药物被包裹的比例随之提高。此外，表5、表6说明乳化温度与油、水滴加顺序对辣椒碱纳米乳包封率的影响不大。
【 参考 文献】
［1］ 张志栋.辣椒碱的研究进展［j］.天津药学,1997，9（2）：16-17.
［2］ 吴明光.新型长效镇痛药辣椒碱研究进展［j］.
