作者：段炼，李国锋，孙亚彬，周望梅，李科
【摘要】 目的 研究辣椒素经大鼠空肠、回肠和结肠黏膜的区段透过特性。方法 应用体外ussing chamber法，评价100 μg·ml-1辣椒素经空肠、回肠和结肠黏膜的经时吸收方向的累计透过量，并 计算 表观渗透系数,辣椒素在接收池中的浓度用hplc法测定。结果 辣椒素经结肠和回肠的透过性显著高于空肠，在结肠的透过性也显著高于回肠。结论 辣椒素在大鼠肠黏膜中的透过性存在区段性差异，在空肠部位吸收最差，结肠部位吸收最好，可考虑将其制成结肠定位肠溶片。
【关键词】 辣椒素;ussing chamber;肠黏膜;透过性
abstract:objective to investigate the permeability of capsaicin across the jejunum, ileum and colonic membranes in rats. methods with in vitro ussing chamber experiments, the accumulated absorptive amount of capsaicin permeated through jejunum, ileum and colonic membranes at 100 μg·ml-1 concentration was evaluated at different time points, and the apparent permeability coefficient(papp) was calculated.results the permeability of capsaicin through colonic or ileal membranes was higher than that across the jejunal membrane. and the permeability of capsaicin through colon is also higher than that through ileum.conclusion regional differences in the permeability of capsaicin across the jejunum, ileum and colon in rats were observed, which showed the highest in the colon and the lowest in the jejunum. therefore, the colonspecific delivery dosage form of capsaicin could be developed.
key words:capsaicin; ussing chamber; intestinal mucosa; permeability
辣椒是在全世界被广泛消费的蔬菜和香料之一,其主要的辛辣成分是辣椒素。WWw.11665.CoM辣椒素(capsaicin,cap)是辣椒中的主要生物活性成分，化学名为(e)n(4羟基3甲氧基苄基)8甲基6壬烯酰胺，熔点62～65 ℃。辣椒素对带状疱疹后遗性神经痛、风湿性关节炎、骨关节炎、糖尿病性神经痛及银屑病等的临床 治疗 效果已得到充分肯定[1-2]。辣椒素的应用已经非常广泛，尤其在近几年，辣椒素的抗癌作用更是受到关注，然而辣椒素难溶于水，刺激性大，并具有高度的肝首过效应及非常短的半衰期[3]，限制了辣椒素的使用。经查阅 文献 ，辣椒素在胃肠道的吸收情况目前尚未见报道。本研究通过ussing chamber实验[4]研究了辣椒素经不同区段肠黏膜的渗透性，为辣椒素口服制剂的开发提供依据。
1 材料与试剂
高效液相色谱仪(岛津lc20a 系列);ussing chamber装置(navicyte);hepes、trizma base(美国sigma公司);ph计(thermo orion model868);戊巴比妥钠[ 中国 医药(集团)上海化学试剂厂];辣椒素标准品(购于sigmaaldrich);甲醇为色谱纯;其余试剂为分析纯; sd雄性大鼠 (南方医科大学实验动物中心提供，许可证号：scxk粤20060015),体质量(250±20) g。
2 方法
2.1 色谱条件 色谱柱为ecosil c18 (150 mm×4.6 mm,5 μm)，流动相：甲醇水(体积比70∶30)，流速:1.2 ml·min-1，分析时间：7 min，检测波长：280 nm。
2.2 体外ussing chamber实验
2.2.1 溶液配制
hepestris缓冲液的配制(现配现用):取hepes约6 g，精密称定，用800 ml蒸馏水使之完全溶解。通入混合气体(95%o2∶5%co2)10 min后，加入3 mol·l-1 kcl溶液1.8 ml，1 mol·l-1cacl2溶液1.8 ml，1 mol·l-1mgso4溶液0.8 ml， nacl 8.18 g，完全溶解后用tris溶液(1 mol·l-1)调节ph至7.4，再加入1 mol·l-1葡萄糖溶液5 ml，用蒸馏水稀释至1 000 ml，混匀即得。
辣椒素供试液的配制:称取辣椒素100 mg，用乙醇定容至10 ml容量瓶中，得到10 g·l-1储备液，精密量取1 ml储备液，用hepestris缓冲液定容至100 ml，混匀即得质量浓度为100 μg/ml的供试液。
2.2.2 空肠、回肠和结肠黏膜透过实验
雄性sd大鼠6只，体质量为(250±20)g，禁食16～18 h, 3%戊巴比妥钠腹腔注射(12 ml·kg-1)麻醉，延腹中线将腹部切开2.5 cm左右，将小肠顶部的5 cm去除，接着的10 cm小肠作为空肠，最后的10 cm作为回肠。大肠的最初2 cm去除，接着的6 cm被作为结肠。分别用生理盐水清洗干净，置入冰浴的hepestris缓冲液中通混合气(95%o2∶5%co2)培养。剪取空肠3～4 cm，于冰浴板上迅速剥离浆膜侧的浆膜层，将肠黏膜固定于扩散池上，回肠及结肠的操作方法与空肠相同，扩散室的有效面积为1.78 cm2。在扩散室加入7 ml辣椒素溶液(0.1 g·l-1)，接收室加入7 ml hepestris缓冲液(均预热至37.5 ℃);37.5 ℃保温，并通入混合气体。分别于30、60、75、90、120 min在接收室取样0. 5 ml，并同时补充相同体积、相同温度的hepestris缓冲液。
2.2.3 结果的处理 用0.1 g·l-1辣椒素分别对大鼠空肠、回肠和结肠做体外ussing chamber实验，hplc检测透过药物含量，用下列公式计算各透过参数：(1)累积透过量(qtn，单位：mg) =7ctn+∑n-1i=10.5ct(n-1),式中，0.5和7表示取样体积和加入药液量分别为0.5 ml和7 ml，ctn表示给定时间点接收室药物浓度;(2)累积透过率(%)=qtn/d×100，式中的d为给药剂量;(3)表观渗透系数(papp，单位：cm·s-1)=(dq/dt)×(1/ac0)，其中dq/dt表示稳态时时间-累积透过量线性回归所得斜率，a为有效渗透面积1.78 cm2，c0为扩散室加入的初始药物浓度。
3 结果
3.1 方法学考察结果
3.1.1 线性关系考察 精密称取辣椒素0.010 g，用乙醇定容至100 ml,得到0.1 g·l-1的辣椒素贮备液，将上述贮备液用乙醇依次等倍稀释，分别得到质量浓度为25 000、12 500、6 250、3 125、1 562.5、781.25、390.63、195.32 μg·l-1的对照品溶液，0.45 μm滤膜过滤后，各取20 μl进样分析，以质量浓度(ρ)为纵坐标，峰面积(a)为横坐标，得标准曲线方程： ρ=0.0009a-0.0383,r2=0.999 9， 线性范围是195.32～12 500 μg·l-1。典型的 hplc图谱见图1所示，可见空白透过液对药物的测定没有干扰。
a.空白;b.样品;c.对照品
图1 辣椒素典型色谱图
figure 1 hplc chromatographs of capsaicin in different conditions
3.1.2 精密度试验 配制高、中、低3个浓度(12 500，3 125，195.32 μg·l-1)的对照品溶液，0.45 μm滤膜过滤后，于1 d内重复测定5次，计算日内rsd，连续测定5 d，计算日间rsd，结果日内和日间rsd均小于3%(n=5)，表明方法精密度良好。
3.1.3 回收率试验 以当前样品含量的50%、100%和150%配制辣椒素供试品溶液，每个含量2份，共6份，分别精密加入辣椒素对照品溶液(100 μg/ml)1 ml，再分别精密加入甲醇10 ml，依法测定，计算辣椒素的回收率，结果平均回收率为101.36%，rsd为1.63%。
3.2 辣椒素经不同肠黏膜的透过性比较
辣椒素经不同肠黏膜透过的特性如图2、图3所示，经统计软件spss13分析，辣椒素在回肠中吸收方向的透过量显著性高于空肠(p<0.01),辣椒素在结肠中吸收方向的透过量也显著性高于回肠(p<0.01)，说明辣椒素在肠内的最佳吸收部位是结肠。
4 讨论
药物在肠道内吸收的研究方法有离体、在体、体内等几种方法。caco2单层一般认为是药物转运研究的一种合适的体外模型,因为这些单层细胞具有小肠黏膜的大多数酶、功能和形态学特征[5]。然而，由于caco2单层细胞有以下缺点[6]：(1)缺乏粘蛋白产生细胞，即缺少肠壁的粘膜层，而粘膜层是吸收的主要屏障之一;(2)caco2细胞是人克隆结肠腺癌细胞，过度表达pgp，体内外数据的相关性较差;(3)该模型不能说明生理参数，如小肠流动性或运送时间在药物分子吸收中的作用;(4)细胞培养的时间和代系对于caco2细胞的形态学和生 理学 性质有影响，从而影响细胞对药物的转运;(5)不能预测药物在胃肠道吸收的区段差异，因此应用该模型研究药物的吸收情况与体内的差异性较大。
体外扩散池(ussing chamber)实验在研究药物的肠吸收和代谢方面已有一定的应用[7,8]，原理是：药物可以在肠段特定的位置吸收和通过，通过测定该特定肠段的药物量，然后根据药物的有效渗透系数来评价药物吸收的动力学变化。在ussing chamber中，电参数显示组织的活性和完整性能够至少保持4 h，这是因为肠黏膜细胞中的紧密连接结构(反映耐药性)仍保持完整，这是一个高能量过程[9]。在相关性方面，ussing chamber中通过被动扩散和载体介导机制检测了化合物在空肠段转运的papp，并与相应的人体数据进行比较;化合物的被动转运在大鼠空肠段(体外)和人体空肠(体内)的papp和等级次序是相似的;当低和高papp的药物(被动转运)比较时两种模型的数据有高度相关性(r2=0.95)[10]。实验证明ussing chamber对于预测人体内胃肠道药物吸收情况是一种有效的工具。因此，本实验应用ussing chamber对辣椒素的肠区段透过性进行研究。
一般认为小肠是药物吸收的主要场所，结肠由于有效吸收面积比小肠小，因此不是药物和营养物质的主要吸收场所。但本研究发现，辣椒素的吸收与其他许多药物吸收不同，在结肠部位的吸收显著性大于空肠和回肠，提示可将辣椒素设计成结肠定位给药剂型，有望增加其生物利用度。目前，我们正在利用原位实验以及结肠制剂技术等来验证辣椒素的这种口服吸收特点，并拟进一步探讨可能的经胃肠道转运机理。
【 参考 文献】
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a.空白;b.样品;c.对照品
图1 辣椒素典型色谱图
figure 1 hplc chromatographs of capsaicin in different conditions
3.1.2 精密度试验 配制高、中、低3个浓度(12 500，3 125，195.32 μg·l-1)的对照品溶液，0.45 μm滤膜过滤后，于1 d内重复测定5次， 计算 日内rsd，连续测定5 d，计算日间rsd，结果日内和日间rsd均小于3%(n=5)，表明方法精密度良好。
3.1.3 回收率试验 以当前样品含量的50%、100%和150%配制辣椒素供试品溶液，每个含量2份，共6份，分别精密加入辣椒素对照品溶液(100 μg/ml)1 ml，再分别精密加入甲醇10 ml，依法测定，计算辣椒素的回收率，结果平均回收率为101.36%，rsd为1.63%。
3.2 辣椒素经不同肠黏膜的透过性比较
辣椒素经不同肠黏膜透过的特性如图2、图3所示，经统计软件spss13分析，辣椒素在回肠中吸收方向的透过量显著性高于空肠(p<0.01),辣椒素在结肠中吸收方向的透过量也显著性高于回肠(p<0.01)，说明辣椒素在肠内的最佳吸收部位是结肠。
4 讨论
药物在肠道内吸收的研究方法有离体、在体、体内等几种方法。caco2单层一般认为是药物转运研究的一种合适的体外模型,因为这些单层细胞具有小肠黏膜的大多数酶、功能和形态学特征[5]。然而，由于caco2单层细胞有以下缺点[6]：(1)缺乏粘蛋白产生细胞，即缺少肠壁的粘膜层，而粘膜层是吸收的主要屏障之一;(2)caco2细胞是人克隆结肠腺癌细胞，过度表达pgp，体内外数据的相关性较差;(3)该模型不能说明生理参数，如小肠流动性或运送时间在药物分子吸收中的作用;(4)细胞培养的时间和代系对于caco2细胞的形态学和生 理学 性质有影响，从而影响细胞对药物的转运;(5)不能预测药物在胃肠道吸收的区段差异，因此应用该模型研究药物的吸收情况与体内的差异性较大。
体外扩散池(ussing chamber)实验在研究药物的肠吸收和代谢方面已有一定的应用[7,8]，原理是：药物可以在肠段特定的位置吸收和通过，通过测定该特定肠段的药物量，然后根据药物的有效渗透系数来评价药物吸收的动力学变化。在ussing chamber中，电参数显示组织的活性和完整性能够至少保持4 h，这是因为肠黏膜细胞中的紧密连接结构(反映耐药性)仍保持完整，这是一个高能量过程[9]。在相关性方面，ussing chamber中通过被动扩散和载体介导机制检测了化合物在空肠段转运的papp，并与相应的人体数据进行比较;化合物的被动转运在大鼠空肠段(体外)和人体空肠(体内)的papp和等级次序是相似的;当低和高papp的药物(被动转运)比较时两种模型的数据有高度相关性(r2=0.95)[10]。实验证明ussing chamber对于预测人体内胃肠道药物吸收情况是一种有效的工具。因此，本实验应用ussing chamber对辣椒素的肠区段透过性进行研究。
一般认为小肠是药物吸收的主要场所，结肠由于有效吸收面积比小肠小，因此不是药物和营养物质的主要吸收场所。但本研究发现，辣椒素的吸收与其他许多药物吸收不同，在结肠部位的吸收显著性大于空肠和回肠，提示可将辣椒素设计成结肠定位给药剂型，有望增加其生物利用度。目前，我们正在利用原位实验以及结肠制剂技术等来验证辣椒素的这种口服吸收特点，并拟进一步探讨可能的经胃肠道转运机理。
【 参考 文献 】
[1] 高蓝，李浩明.辣椒素及其在医药中的应用[j].
