【摘要】 目的： 观察过氧亚硝基阴离子（onoo-）对谷氨酸脱氢酶（gdh）的硝基化修饰及功能调控. 方法 ： gdh与onoo-体外反应，测定酶活性及别构调节效应，western blot检测gdh硝基化修饰；制备含“去硝基化酶”的脾脏蛋白，观察能否逆转onoo-作用. 结果： 4~12 μmol/l onoo-不 影响 gdh活性和二磷酸腺苷(adp)别构激活作用，但使三磷酸鸟苷（gtp， 10 μmol/l）别构抑制作用由（49±4）%降低至（69±7）%和（75±3）%；36~108 μmol/l onoo-使gdh活性由（0.81±0.05） kat/kg降低至（0.55±0.06）和（0.29±0.07） kat/kg，使gtp（10 μmol/l）别构抑制作用降低至（83±4）%和（95±7）%；324 μmol/l onoo-使gdh完全失活. western blot检测到onoo-使gdh发生硝基化修饰．脾脏蛋白可部分逆转上述作用. 结论： onoo-可通过硝基化修饰调控gdh催化功能.
【关键词】 谷氨酸脱氢酶；过氧亚硝酸；酪氨酸硝基化修饰；别构调节
0引言
谷氨酸脱氢酶（glutamate dehydrogenase，gdh）催化l谷氨酸与α酮戊二酸相互转化，是联系氨基酸和糖代谢的枢纽. gdh在细胞内可能会发生酪氨酸硝基化修饰［1］，但该修饰对酶催化功能的影响尚少见报道. 鉴于体内蛋白硝基化主要通过过氧亚硝基阴离子(peroxynitrite, onoo-)介导［2］，同时gdh催化功能被别构激活剂二磷酸腺苷(adenosine 5′diphosphate, adp)和抑制剂三磷酸鸟苷（guanosine 5′triphosphate, gtp）调节［3］，本 研究 观察onoo-对gdh催化活性和别构调节的影响.
1材料和方法
1.1材料牛肝脏gdh纯酶（type i, ammonium sulfate suspension, ≥40 units/mg protein），还原型辅酶i（βnadh），α酮戊二酸，脂多糖(from escherichia coli 055:b5) (美国sigma公司)；抗硝基化蛋白mab(antinitrotyrosine, antint，美国cayman chemical公司)；硫酸铵，adp，gtp(美国amresco公司)；smartspec 3000型分光光度计(美国biorad公司).
1.2方法
1.2.1onoo-合成与定量硝酸化的双氧水与亚硝酸钠，以三通管迅速推入氢氧化钠溶液，得黄色产物，以消光系数1.670 (mmol/l)-1 ·cm-1定量［4］.
1.2.2gdh与onoo-反应gdh透析除去硫酸铵，蛋白浓度调整为0.2 mg/ml，取300 μl置于1.5 ml离心管，另取1 μl onoo-置于离心管内壁，使反应体系中onoo-的终浓度为0，4，12，36，108和324 μmol/l，快速震荡10 s，加入300 μl缓冲液终止反应，立即进行酶活性测定和硝基化修饰检测.
1.2.3gdh催化活性测定按照 参考 文献 ［5］的方法进行测定，反应体系为250 μl，包含50 mmol/l磷酸钠缓冲液(ph 7.4), 50 mmol/l硫酸铵, 160 μmol/l βnadh, 5 mmol/l α酮戊二酸和5 μl gdh酶溶液；记录3 min内340 nm吸光度改变量. 以βnadh的消光系数6.22 (mmol/l)-1·cm-1 计算 底物消耗速率，由公式［(△a 340 nm/min)/6.22］×250 μl×10-3÷0.5 μg计算每1 μg gdh每分钟转换底物的速度，每分钟转换1 μmol底物定义为1单位，将单位值折算为比催化活性kat/kg.
1.2.4gdh别构调节效应测定为测定adp的别构激活效应，在反应体系中加入新鲜配置的adp，使其终浓度为300 μmol/l，并以氢氧化钠调整ph 8.0, 然后测定gdh催化活性；为测定gtp的别构抑制效应，在反应体系中加入10 μmol/l gtp，然后测定gdh催化活性［5］.
1.2.5western blot检测gdh硝基化修饰onoo-处理后的gdh立即进行sdspage分离，每泳道上样量为50 ng；其中一块凝胶用于银染以确保上样量一致，另一块凝胶进行湿法转膜，硝酸膜用50 g/l脱脂奶粉封闭1 h后，与antint（1∶5000）反应过夜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶10 000）进行检测.
1.2.6脾脏蛋白对gdh修饰的影响按照参考文献［6］的方法制备脾脏蛋白，雄性sd大鼠，腹腔注射脂多糖20 mg/kg，24 h后，取脾脏，以trishcl(ph 7.4)匀浆，105 000 g离心，1 h，保留上清得脾脏蛋白，其中含有较高浓度的“去硝基化酶”［6］. onoo-处理后的gdh,蛋白浓度调整为0.01 mg/ml，与等体积的脾脏蛋白（6 mg/ml）室温反应2 h，取 50 μl与等体积的2×电泳上样缓冲液混合，每泳道上样20 μl，进行western blot 检测硝基化修饰的改变，同时取50 μl检测催化活性. 作为对照，将脾脏蛋白煮沸5 min，以灭活“去硝基化酶”，进行平行实验. 以上实验均重复6次.
统计学处理：计量数据以x±s表示，以spss13.0软件包进行方差 分析 (anova)，多重比较采用studentnewmankeuls检验法.
2结果
2.1onoo-对gdh催化活性和别构调节的 影响 onoo-在4~12 μmol/l时不影响gdh催化比活性，但在36~108 μmol/l时，可显著抑制其催化比活性(p<0.01 vs 对照组). 在324 μmol/l时，gdh被完全灭活，其活性检测不到．gdh可被别构激活剂adp激活2.58倍,该效应不受onoo-影响，但是gtp的别构抑制效应则显著降低(4~108 μmol/l vs 对照组，p<0.01). 含有“去硝基化酶”的脾脏蛋白，可部分逆转36 μmol/l onoo-对gdh催化比活性的抑制作用，但是对于108 μmol/l onoo-处理的样品和完全失活的gdh则没有作用. 经过煮沸灭活“去硝基化酶”，脾脏蛋白的作用则完全消失（表1）.
表1onoo-对gdh活性的影响及脾脏蛋白的逆转作用（略）
bp<0.01 vs 对照.
2.2onoo-导致gdh发生硝基化修饰 0 μmol/l onoo-处理的gdh与antint抗体不发生反应（泳道1），而4～324 μmol/l onoo-处理的gdh可被antint抗体识别，并且免疫反应的信号强度随onoo-浓度增加而增大（泳道2~6，图1）.
1： 0 μmol/l onoo-； 2~6： 4，12，36，108，324 μmol/l onoo-.
图1western blot 法检测onoo-导致的gdh硝基化修饰（略）
2.3脾脏蛋白可部分逆转onoo-对gdh的硝基化修饰4~36 μmol/l onoo-处理的gdh与antint抗体发生免疫反应（泳道1，4，7），样品经脾脏蛋白处理后，免疫信号被部分逆转（泳道2，5，8），而煮沸灭活的脾脏蛋白则不影响免疫反应强度（泳道3，6，9）（图2a）. 0 μmol/l onoo-处理的gdh不与antint 反应（泳道1），同时加入脾脏蛋白也不与antint反应（泳道2和3），而108，324 μmol/l onoo-处理的gdh与antint有明显的反应条带（泳道4和7），脾脏蛋白（泳道5和8）不能逆转这种反应，煮沸的脾脏蛋白（泳道6和9）也没有作用（图2b）.
a： 1，4，7: 4，12，36 μmol/l onoo-； 2，5，8: 4，12，36 μmol/l onoo- +脾脏蛋白； 3，6，9: 4，12，36 μmol/l onoo- +煮沸的脾脏蛋白. b： 1，4，7: 0，108，324 μmol/l onoo-； 2，5，8: 0，108，324 μmol/l onoo- +脾脏蛋白； 3，6，9: 0，108，324 μmol/l onoo- +煮沸的脾脏蛋白.
图2western blot 法检测脾脏蛋白对onoo-诱导gdh硝基化修饰的逆转作用（略）
3讨论
目前 已有逾百种硝基化蛋白被鉴定［1］，但针对特定蛋白的功能调控尚知之甚少. 本 研究 首次报道，硝化剂onoo-对gdh这一典型的别构酶［7］具有功能调控作用.
本研究发现，onoo-的作用与浓度密切相关： 低浓度（4~12 μmol/l ）onoo-不影响gdh催化活性，但使gtp的别构抑制作用显著降低，从而可间接地使gdh的总催化活性升高；中等浓度（36~108 μmol/l）onoo-，一方面可显著抑制gdh催化活性，另一方面使gtp的别构抑制作用降低，二者综合的结果可使gdh总的催化活性或者升高，或者降低，或者不变；高浓度（324 μmol/l）onoo-，可使gdh完全灭活，别构调节作用也完全丧失. gdh这些功能改变与酪氨酸硝基化呈正相关．由此可以推测gdh硝基化可能是机体的一种感受机制，当内环境发生改变导致onoo-过量产生时，gdh通过硝基化的方式来调控其总催化活性（升高，降低，或者不变）；当内环境改变超出了机体的反馈能力后，gdh的硝基化则成为一种损伤机制（彻底灭活）.
硝基化一般导致蛋白功能丧失［2］. 但本研究发现，gdh硝基化可使其催化功能间接地升高，这与微粒体谷胱甘肽s转移酶1（mgst1）的硝基化具有类似之处［8］. 两者不同之处在于，gdh在活性调控上比mgst1更具有灵活性：前者总的催化活性可升可降亦可不变，后者的催化活性只是升高；前者的修饰可被逆转，后者修饰的逆转性尚未确立；此外，mgst1被onoo-修饰，还可形成蛋白二聚体和三聚体［8］，而本研究未发现gdh存在这些修饰.
值得指出，高浓度（324 μmol/l）onoo-诱发的硝基化不能被“去硝基化酶”逆转，提示onoo-可能还导致gdh发生了其他修饰，例如羰基化等，引起酶构象发生改变，从而不能被“去硝基化酶”识别．作者初步研究结果支持这一推测，我们发现，108~324 μmol/l onoo-处理gdh样品，可分别检测到（0.89 ± 0.18）和（1.69 ± 0.16） nmol/mg羰基基团，而0~36 μmol/l onoo-处理的样品检测不到，提示高浓度onoo-不仅导致硝基化，同时引起了羰基化修饰.
综上所述，本研究表明onoo-可通过酪氨酸硝基化调控gdh的催化功能.
【 参考 文献 】
［1］ aulak ks, miyagi m, yan l, et al. proteomic method identifies proteins nitrated in vivo during inflammatory challenge ［j］. proc natl acad sci usa, 2001,98(21):12056-12061.
［2］ 池泉，黄开勋. 蛋白质酪氨酸硝化的研究 ［j］. 化学进展，2006，18（7/8）：1019-1025.
［3］ choudhury r, punekar ns. competitive inhibition of glutamate dehydrogenase reaction. ［j］. febs lett, 2007,581(14):2733-2736.
［4］ lai hh, yen gc. inhibitory effect of isoflavones on peroxynitritemediated lowdensity lipoprotein oxidation［j］. biosci biotechnol biochem, 2002,60(1):22-28.
［5］ kanavouras k, mastorodemos v, borompokas n, et al. properties and molecular evolution of human glud2 (neural and testicular tissuespecific) glutamate dehydrogenase［j］. j neurosci res, 2007,85(5):1101-1109.
［6］ irie y, saeki m, kamisaki y, et al. histone h1.2 is a substrate for denitrase, an activity that reduces nitrotyrosine immunoreactivity in proteins ［j］. proc natl acad sci usa,2003,100(10):5634-5639.
［7］ smith tj, peterson pe, schmidt t, et al. structures of bovine glutamate dehydrogenase complexes elucidate the mechanism of purine regulation ［j］. j mol biol, 2001,307(2):707-720.
［8］ ji y, neverova i, van eyk je, et al. nitration of tyrosine 92 mediates the activation of rat microsomal glutathione stransferase by peroxynitrite［j］. j biol chem, 2006,281(4):1986-1991.
