【关键词】 蜂毒素
蜂毒素是蜂毒的主要成分，具有多种生物学活性，近年来的研究揭示了其抗肿瘤作用，引起了人们的广泛关注，有研究显示蜂毒素对肝癌bel7402、smmc7721、hep3b［1,2］、t淋巴细胞白血病6tcem［3］等多种肿瘤细胞具有明显的增殖抑制及诱导凋亡作用，但目前蜂毒素诱导肿瘤细胞凋亡的机制还不十分清楚。本研究观察了蜂毒素对人骨肉瘤u2os细胞生长增殖抑制和诱导细胞凋亡的作用，探讨了线粒体膜电位及凋亡相关蛋白bcl2、bax表达变化，旨在探讨其诱导机制。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 化学试剂及蜂毒素 mem培养基、胎牛血清购自美国gibco公司，胰蛋白酶和rodamine123购自美国sigma公司，鼠抗人bcl2单克隆抗体及bax鼠抗人多克隆抗体购自santa cruz公司。蜂毒素由长海医院中医科实验室提取、纯化，用生理盐水配置成1mg/ml，-20℃冷冻保存备用。
1.1.2 细胞株和细胞培养 骨肉瘤u2os细胞株购自中国科学院上海细胞研究所，采用含10％胎牛血清的dmem完全培养基，在37℃、体积分数为5％co2、完全饱和湿度条件下常规培养，用0.25％胰蛋白酶和0.02％edta按1∶1混合的消化液消化细胞，2～3d进行传代培养，取对数生长期细胞进行实验。WWW.11665.com
1.2 实验方法
1.2.1 mtt法测定细胞增殖抑制率及半数有效抑制浓度（ic50） 取对数生长期u2os细胞，以1×104/孔的密度接种于96孔板，常规培养，培养体系为100μl。培养24h细胞贴壁后，设对照组及实验组，每组设6个复孔，实验组分别加入终浓度为1、2、4、8、16和32μg/ml的蜂毒素分别作用12、24、36h。实验结束前4h每孔加入mtt 10μl（浓度为5mg/ml），终止实验时取出96孔板，弃上清，滤纸吸干浮液，每孔加dmso 150μl，充分溶解，置标仪上测定吸光度a值，测定波长为492nm，按以下公式计算生长抑制率：
抑制率＝（对照组a值-实验组a值）/对照组a值×100％
应用药物抑制浓度计算软件（loggt法）计算ic50值。
1.2.2 透射电镜形态观察 作用12h后收集细胞，2.5%戊二醛前固定，1%锇酸后固定，常规电镜标本制作，在h600型透射电镜下观察细胞超微结构。
1.2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡率 作用12h后，收集细胞并重悬于binding buffer（结合缓冲液）中，加荧光标记的annexin v和pi，室温避光孵育15min, 流式细胞仪检测细胞凋亡率。
1.2.4 流式细胞仪测定线粒体膜电位(δψm)的变化 作用12h后，消化、收集细胞。pbs洗2次，细胞重悬于0.5ml pbs中，加入rh123使其终浓度为10mg/ml。37℃避光孵育30min，pbs再洗1次，上流式细胞仪检测。
1.2.5 免疫细胞化学法检测bcl2和bax蛋白表达变化 取对数生长期u2os细胞，以2×105个/每孔接种预先置有盖玻片的无菌六孔培养板中，培养过夜后分别加入终浓度为2、4、8μg/ml的蜂毒素，另设无药物处理的空白对照组，继续培养12h，取出盖玻片，按bcl2和bax免疫组化试剂盒操作说明书进行染色、固定。bcl2和bax染色信号均为棕黄色，定位于细胞浆。结果判定方法为光镜下以细胞浆有明显棕黄色为阳性细胞。采用ims计算机细胞图像分析系统进行阳性表达强度的定量分析，光镜下（×250）随机选3个视野，通过预设采样程序得出阳性面积百分比（positive area rate）和平均光密度值（average od value），两者的乘积为免疫细胞化学阳性指数（positive index，pi）。
1.3 统计学方法
应用spss 11.0对实验数据进行分析，数据结果均采用±s表示，多组间比较先行方差齐性检验，方差齐者进行单因素方差分析，两两比较采用newmankeuls检验（q检验）；方差不齐者进行成组秩和检验(kruskalwallis法)，两两比较用nemenyi法。
2 结果
2.1 蜂毒素对骨肉瘤u2os细胞的生长抑制作用
loggt法测得ic50值为7.12μg/ml，在2～8μg/ml浓度范围内对u2os细胞增殖抑制作用具有明显的剂量和时间依赖性，见图1。
图1 蜂毒素对u2os细胞的生长抑制作用
fig 1 the inhibitive effect of melittin on u2os cell line
2.2 透射电镜形态观察
对照组骨肉瘤细胞染色质均匀分布，细胞核不规则呈多角形，个别细胞胞浆中含有脂滴。蜂毒素2μg/ml处理组细胞胞浆疏松，胞膜隐约可见，染色质边集，出现了典型的凋亡早期超微结构变化。4μg/ml组胞浆散落，染色质凝集，有凋亡小体出现，8μg/ml亦可见凋亡小体，见图2。
2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡率
蜂毒素各剂量组产生的凋亡率与对照组相比均有所增高，差异具有统计学意义（p<0.01），且随着剂量增高，凋亡率亦随之增高（p<0.01），见表1。表1 annexin v/pi双染法检测蜂毒素诱导u2os细胞 凋亡率不同浓度的蜂毒素处理u2os细胞后，可见各浓度组平均荧光强度逐渐降低，4、8μg/ml组与0μg/ml组相比差异具有统计学意义（p<0.05），见表2。表2 蜂毒素作用前后平均荧光强度变化
2、4、8μg/ml蜂毒素作用u2os细胞12小时后，bcl2蛋白表达较0μg/ml组无显著变化（p>0.05），bax蛋白表达在蜂毒素浓度为4、8μg/ml时显著增强，与0μg/ml组及2μg/ml组相比，差异均具有统计学意义（p<0.05），见表3。
3 讨论
蜂毒素是蜂毒的主要活性成分，具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗关节炎、抗肿瘤等多方面的作用。随着蜂毒分离、提取、纯化技术的不断提高，对蜂毒素的功能及作用机制的研究也日益广泛。有关蜂毒抗肿瘤的机制研究近几年来取得了新进展，已有研究发现蜂毒素抗肿瘤生物活性是通过诱导肿瘤细胞凋亡实现的，它能通过插入细胞膜内形成孔道，而引起ca2+内流，胞内ca2+浓度升高可引起细胞裂解，导致细胞凋亡。hwang等［4］的研究表明蜂毒能够诱导人骨肉瘤细胞系mg63细胞凋亡并抑制cox2蛋白的表达。此后，ahn等［5］报道蜂毒素诱导肺癌细胞凋亡与增加bax蛋白表达、激活半胱氨酸蛋白酶有关。但总体来讲，目前对蜂毒素诱导肿瘤细胞凋亡的具体机制尚不十分清楚。
线粒体连接着若干个凋亡途径，在凋亡中扮演着重要的角色。线粒体膜电位的丧失是线粒体被激活的显著特征之一。线粒体的跨膜电位下降被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件，线粒体的膜电位一旦崩溃则细胞的凋亡将不可逆转［6］。在细胞信号传导的调控中，bcl2家族蛋白和基因在线粒体参与的凋亡途径中起重要的调控作用。bcl2家族成员中的蛋白分为抗凋亡与促凋亡两类，抗凋亡的因子包括bcl2和 bclx；而bax、bad、bak和bid组成前凋亡成员。凋亡的发生和阻止取决于家族成员的相对比例，并反映其二聚化状态。bcl2的同源二聚体阻止凋亡，而bax的同源二聚体产生相反效应，bcl2和bax的异源二聚体是没有活性的。细胞中两个蛋白的相对比例决定了反应的本质，在线粒体凋亡途径中，bax/bcl2比率变化影响线粒体膜的通透性，比值增大使线粒体膜通透性加大，引起细胞色素c的释放，激活caspase9，最后激活caspase3，使细胞发生凋亡。
我们的检测结果显示，4、8μg/ml蜂毒素处理后的u2os细胞，其线粒体膜电位明显降低，说明蜂毒素能够通过影响线粒体的功能而影响细胞生理活性，蜂毒素可能通过使u2os细胞线粒体膜电位去极化而激活线粒体介导的细胞凋亡途径。
我们应用不同浓度蜂毒素作用u2os细胞12小时后，bcl2蛋白表达无显著变化（p>0.05），bax蛋白表达在蜂毒素浓度为4、8μg/ml时较对照组及2μg/ml组显著增强，差异具有统计学意义（p<0.05），说明其诱导bax蛋白表达增强具有一定的剂量依赖关系。黄雪强等［7］的实验研究表明蜂毒素诱导人t淋巴细胞白血病细胞凋亡与bcl2基因表达明显下降有关。国外亦有研究［8］显示蜂毒能够体外抑制白血病u937细胞增殖并诱导其凋亡，其凋亡诱导作用可能与bcl2的下调和caspase3的激活密切相关。与本研究结果不尽相同，考虑可能因不同细胞系之间存在着生物特性差异，各基因表达水平不同，对外界刺激引起的反应不同。我们的结果证明蜂毒素可增高bax/bcl2比例，由此推断其后续的效应可能是促进baxbax同源二聚体的形成，后者大量定位于线粒体膜，从而诱发线粒体膜电位转换孔开放及线粒体膜电位耗散，诱导u2os细胞凋亡。
然而，细胞的凋亡过程存在着一个复杂的调控网络，蜂毒素诱导骨肉瘤细胞凋亡是否还通过调节其他相关基因以及影响相关信号传导途径有待于进一步深入研究。
【参考文献】
［1］ li b, gu w, zhang c, et al. growth arrest and apoptosis of the human hepatocellular carcinoma cell line bel7402 induced by melittin[j]. onkologie, 2006, 29(89):367371.
［2］ 刘岭, 凌昌全, 黄雪强. 蜂毒素的纯化方法及体外抗肿瘤的实验研究[j]. 中国生化药物杂志, 2003, 24(4):163－166.
［3］ 黄雪强, 凌昌全, 陈哲，等. 蜂毒素诱导人t淋巴细胞白血病细胞株6tcem的凋亡作用[j]. 安徽中医学院学报, 2001, 20(5):3941.
［4］ hwang dy, kim hh, kim cj, et al. bee venom induces apoptosis and inhibits cox2 in human osteosarcoma cell line mg63[j]. j kor acup mox soc, 2003, 20 (3): 6374.
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［6］ chen c, shen g, hebbar v, et al. epigallocatechin3gallateinduced stress signals in ht29 human colon adenocarcinoma cells[j]. carcinogenesis, 2003, 24(8):13691378.
