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低频脉冲电磁场对大鼠骨髓源性内皮祖细胞增殖活性和NO分泌的影响

              作者:马彦卓,许旭东,韩凯,李飞,曹艳杰,张荣庆,王海昌   

【摘要】  目的: 观察不同作用时间下低频脉冲电磁场对大鼠骨髓源性内皮祖细胞(epcs)增殖活性和no分泌的 影响 . 方法 : 密度梯度离心法获取大鼠骨髓单个核细胞,培养4 d后收集贴壁细胞,每日给予低频脉冲电磁场干预,磁场强度0.6 mt,频率15 hz. 按作用时间的不同分为对照组(0 h)和磁场作用时间组(0.5,2,4,8 h组),各组细胞培养及磁场干预3 d后,分别采用mtt比色法测定epcs的增殖活性,流式细胞仪检测细胞周期,griess法检测培养上清中no水平. 结果: 对照组a490 nm为(0.37±0.07), 0.5 h组(0.37±0.06), 2 h组(0.40±0.09)与对照组(0.37±0.07)相比差异无统计学意义(p>0.05);4 h组a490 nm值开始增加[(0.45±0.03) vs (0.37±0.07); p<0.05], 8 h组较对照组增加最为明显[(0.49±0.08) vs (0.37±0.07);p<0.01]. 0.5 h组,2 h组细胞增殖指数pi(s+g2m)%与对照组相比差异无统计学意义(p>0.05),4 h组,8 h组细胞增殖指数与对照组相比差异均有统计学意义(p<0.05). no分泌随磁场作用时间的延长,其分泌增加. 结论: 低频脉冲电磁场可影响epcs的增殖及no分泌,随着作用时间的延长,细胞增殖及no分泌增加.

【关键词】  电磁场;内皮祖细胞;细胞增殖;一氧化氮

  0引言

  内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,epcs)作为 治疗 性血管形成的 研究 靶点,已发现其不仅参与血管形成,也参与出生后血管生成[1]. 低频脉冲电磁场作为一种外来干预手段,已发现其可促进内皮细胞修复,促进内皮细胞fgf的分泌,提示低频电磁场对血管形成具有促进作用[2]. 我们采用体外培养大鼠骨髓epcs,观察低频脉冲电磁场不同作用时间下骨髓epcs增殖能力和no分泌的变化及其时效关系,并探讨其相关作用机制,以期寻找一种新的促进血管生成的手段.

  1材料和方法

  1.1材料健康雄性sd大鼠30只,体质量80~100 g(第四军医大学实验动物中心);脉冲电磁场发生仪(第四军医大学生物医学工程系);ficoll淋巴细胞分离液( 中国 医学 科学 院生物工程医学研究所);胎牛血清(美国hyclone公司);血管内皮生长因子(vegf),成纤维细胞生长因子(bfgf)(澳大利亚cytolab公司);fitc标记荆豆凝集素ⅰ(fitcueai,美国sigma公司);dii标记的乙酰化低密度脂蛋白(diiacldl,美国molecular probe公司);no试剂盒(南京建成生物工程研究所);激光共聚焦显微镜(美国biorad公司).

  1.2方法

  1.2.1epcs的分离、培养与鉴定[2-3]将大鼠颈椎脱臼处死后,取四肢骨用750 ml/l乙醇浸泡10 min,用5 ml注射器抽取培养液冲洗骨髓液,密度梯度离心法获取单个核细胞,将其接种予培养瓶中,在m199培养基(含100 ml/l fbs,vegf 10 μg/l,bfgf 5 μg/l,l谷氨酰胺300 mg/l,青霉素1×105u/l,链霉素100 mg/l,肝素1.25×104u/l)中培养,差异贴壁法培养4 h后,吸取上清置于新的培养瓶中继续培养4 d. 将培养4 d的细胞消化,接种于盖玻片上,24 h后将细胞爬片行dilacldl与fitcueai直接免疫荧光双染. 向细胞爬片孔内加10 mg/l dilacldl,37℃孵育10 h后,细胞爬片经40 g/l多聚甲醛室温固定10 min,pbs漂洗后加入10 mg/l fitcueai并于37℃避光孵育1 h,pbs洗涤同上,晾干后封片,激光共聚焦显微镜观察. fitcuea和diiacldl双染色阳性细胞为正在分化的epcs.

  1.2.2实验分组pemfs发生仪频率15 hz,磁感应强度:0~1.4 mt可调,线圈直径 200 mm. 调整两线圈距离至100 mm. 将线圈放置在孵箱中,刺激时将细胞放置在两线圈中间位置. 调整需要的强度和频率,实验分组按磁场强度分为对照组(不加磁场干预),0.2 mt, 0.6 mt和1.0 mt各组,贴壁细胞消化后,每组按每日干预时间的不同随机分成0.5,2,4,8 h各亚组. 即每日各组分别干预0.5,2,4 和8 h,共3 d.

  1.2.3细胞活性检测如上述方法收集贴壁细胞并计数. 将等量epcs接种到96孔培养板上,磁场干预3 d后,每孔加5 g/l mtt 20 μl,培养4 h后小心吸弃上清液,每孔加入dmso 150 μl,于微量振荡器充分振荡10 min,使结晶充分溶解,在酶联免疫检测仪上测a490 nm,以空白培养液调零.

  1.2.4细胞周期检测用上述方法消化收集贴壁细胞,再将等量epcs接种到6孔板上,磁场干预3 d后,完全培养液以1000 r/min离心5 min后弃上清,加入冰冷的0.1 mol/l pbs以1000 r/min×5 min洗2次后弃上清,加入1 ml生理盐水制成单细胞悬液. 加预冷的无水乙醇2 ml快速混匀,固定细胞、用封口膜封口,4℃下保存1 h后弃固定液,用pbs洗2次(1000 r/min×5 min)后,加入0.1 ml pbs调整细胞密度,并加入1 ml dna荧光染料,室温下避光染色15 min,置流式细胞仪 分析 . 计算 细胞增殖指数(pri). pri=(s+g2/m)/(g0/g1+ s+g2/m)×100%.

  1.2.5no分泌检测如上述方法收集贴壁细胞并计数. 将等量epcs接种到96孔培养板上,磁场干预3 d后,吸取上清,用griess法测定培养基中no的稳定代谢产物亚硝酸盐(no2-) 浓度,测定方法按照no试剂盒说明书操作, 在酶联免疫检测仪上测a490 nm值,按公式计算no含量.

  统计学处理:各组实验均重复3次. 计量资料以x±s表示, 应用 spss11.0统计软件处理,组间资料比较采用anova,组间两两比较采用lsdt检验,以p<0.05为差异有统计学意义.

  2结果

  2.1epcs的培养及鉴定图片培养的epcs有贴壁生长的特性,刚分离出的细胞呈圆形,折光性强(图1a);培养4 d后,细胞形态多样,为单核,多边形及短梭形(图1b). 用diiacldl和fitcueaⅰ对细胞染色后,通过共聚焦显微镜鉴定,此双染色阳性细胞被认为是正在分化的epcs(图2).

  a: 圆形单个核细胞; b: 短梭形及多边形细胞.

  图1倒置显微镜下内皮祖细胞的形态×200(略)

  a: fitcveai染色; b: dilacldl染色; c: 双染阳性的epc.

  图2激光扫描共聚焦显微镜检测内皮祖细胞的表面标志×200(略)

  2.2磁场不同作用时间对骨髓epcs增殖活性的 影响 经暴磁培养3 d后,epcs增殖活性0.5 h组为(0.37±0.06),2 h组为(0.40±0.09),与对照组(0.37±0.07)相比较,差异无统计学意义(p>0.05). 4 h组(0.45±0.03)的epcs数量开始增加,与对照组相比较,差异具有统计学意义(p<0.05),8 h组(0.49±0.08)较对照组增加最为明显.

  2.3磁场不同作用时间对骨髓epcs细胞周期的影响经暴磁培养3 d后,反映细胞增殖活力的pri(s+g2m)%,0.5 h组和2 h组与对照组相比差异无统计学意义[(7.80±0.80) vs (7.93±0.57);(7.77±0.15) vs (7.93±0.57),p>0.05]. 但随着时间的延长,4 h组细胞pri与对照组相比差异有统计学意义[(11.20±2.59) vs (7.93±0.57);p<0.05],8 h组细胞pri与对照组相比差异具有统计学意义[(14.70±2.01) vs (7.93±0.57);p<0.01].

  2.4磁场不同作用时间对骨髓epcs no分泌的影响经暴磁培养3 d后,0.5 h组(3.76±0.98),2 h组(3.87±0.49) 和4 h组(4.13±0.74)与对照组(3.32±0.24)相比差异无统计学意义(p>0.05);8 h组(5.13±0.65)与对照组相比较差异具有统计学意义(p<0.01).

  3讨论

  磁场具有多方面的生物效应. 在血管形成方面,已发现脉冲电磁场可促进内皮细胞增殖,加快血管内皮损伤处再内皮化过程,并可促进心梗后血管形成[4-6 ]. tepper等[1]发现低频脉冲电磁场可促进血管新生,并推测这一作用与内皮细胞fgf2分泌增加有关.

  epcs是一类能增殖并分化为血管内皮细胞,是血管形成的前体细胞. 但生理情况下,循环epcs的数量相对较少,尤其在一些病理条件下,epc的数目及活性会下降. hill等[7]和vasa等[8]分别报道冠心病患者循环血中的epc数量下降了近50%,迁移能力受损,并与危险因子的数目成反向线性关系,而且高危者epc更易老化. 因而人们采用各种手段来增加epc的数量,促进冠心病患者血管新生和内皮修复. kawamoto等[9]发现体外扩增的epcs注入心肌缺血模型中,可促进缺血部位血管形成. 但低频脉冲电磁场对epcs作用的 研究 报道较少.

  我们的结果提示,同一磁场强度下,不同磁场作用时间可影响epcs增殖活性,具有时间累积效应,短时间内与对照组相比并无统计学差异,随着作用时间的延长,表现出促进细胞增殖的效应. 从细胞周期代谢过程来看.细胞周期各时期的dna含量不同,g1期是dna合成前期,s期是dna合成期,增殖旺盛的细胞处于s期的比例较高. (s+g2m) (pr1)就代表了该群体中增殖期细胞的数量,可反映出细胞增殖的状态 . 我们采用流式细胞仪检测细胞周期,结果发现磁场照射4 h以后,处于增殖期的细胞数量开始增加,这与上述结果一致. 说明低频脉冲电磁场可促进epcs的增殖.

  no作为迄今为止体内最简单的信息传递分子,已发现其具有舒张血管,抗凋亡等作用,stefania等[10]发现no可促进内皮细胞增殖、迁移及管腔形成. 我们发现低频脉冲电磁场作用8 h后no分泌增加. 总之,低频脉冲电磁场可增加体外培养的epcs的数量,促进no分泌,这种作用可能与其对no的生物合成、释放、运转等刺激有关,其具体机制还有待于进一步的研究.

【 参考 文献 】
    [1] tepper om, callaghan mj, chang ei, et al. electromagnetic fields increase in vitro and in vivo angiogenesis through endothelial release of fgf2[j]. faseb j,2004,18(11):1231-1233.

  [2] hill jm, zalos g, halcox jp, et al. circulating endothelial progenitor cells, vascular function, and cardiovascular risk[j]. n eng j med,2003,348(7):593-600.

  [3] kalka c, masuda h, takahashi t, et al. transplantation of ex vivo expanded endothelial prog enitor cells for therapeutic neovascularization[j]. proc natl a2cad sci usa, 2000, 97(7):3422-3427.

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  [5] kocher aa, schuster md, szabolcs mj, et al. neovascularization of ischemic myocardium by human bonemarrowderived angioblasts prevents cardiomyocyte apoptosis, reduces remodeling and improves cardiacfunction[j]. nat med,2001,7:430-436.

  [6] assmus b, schachinger v, teupe c, et al. transplantation of progenitor cells and regeneration enhancement in acute myocardial infarction (topcareami) [j]. circulation,2002,106:3009-3017.

  [7] hill jm, zalos g, halcox jp, et al. circulating endothelial progenitor cells, vascular function, and cardiovascular risk[j]. n engl j med,2003,348:593-600.

  [8] vasa m, fichtlscherer s, aicher a, et al. number and migratory activity of circulating endothelial progenitor cells inversely correlate with risk factors for coronary artery disease[j]. circ res,2001,89:1-7.

  [9] kawamoto a, gwon hc, iwaguro h, et al. therapeutic potential of ex vivo expanded endothelial progenitor cells for myocardial ischemia[j]. circulation,2001,103:634-637.

  [10] stefania b, cristiana p, andrea c, et al. a cellular system to study the role of nitric oxide in cell death, survival, and migration[j]. neurotoxicology,2005,26 (5):841-845.

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