作者：王斌生,曹农,柴琛,俞永江,武光
【摘要】 目的: 探讨蛋白激酶c(pkc)家族成员pkcα和pkcδ在重症急性胰腺炎(sap)大鼠胰腺及肺脏中的动态表达情况和组织病理改变的关系. 方法 ： 胰胆管逆行注射牛黄胆酸钠制成大鼠sap模型，观察胰腺及肺脏病 理学 变化，采用免疫组织化学方法分别检测pkcα，pkcδ在sap大鼠胰腺和肺脏中的表达情况,并进行对比 分析 . 采用逆转录多聚酶链反应（rtpcr）检测96只大鼠胰腺组织中pkc mrna的表达情况. 结果： 建模后1，6，12和24 h假手术（so）组胰腺中pkcα表达分别为0.70±0.04，0.71±0.05，0.75±0.04和0.71±0.07；sap组分别为0.83±0.05, 0.95±0.09, 1.10±0.10和1.08±0.16，两组各时间点之间差异均有统计学意义（p<0.01）. 轻型急性胰腺炎（map）组大鼠建模后胰腺中pkcα表达分别为0.73±0.04, 0.73±0.03, 0.85±0.08和0.84±0.06，与so组各时间点相比，在12 h和24 h差异具有统计学意义（p<0.05），与pkcα相类似，pkcδ的表达在1 h开始增高，12 h达到高峰，且维持时间较长. map组pkcδ在12 h达到高峰，但维持时间较短，24 h时有所减低. 结论： pkcα在sap的病程 发展 中起重要作用. 监测pkcα水平可为sap的早期诊断提供帮助.
【关键词】 胰腺炎;信号传导;蛋白激酶c;逆转录聚合酶链反应
0引言
近年来,重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis, sap)的 研究 多集中在炎症因子通过信号传导引发全身炎性反应综合征(systemic inflammatory response syndrome, sirs) ,并渐进发展成为多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrame, mods)上，但对于sap的早期诊断仍缺乏特异性指标. 已有研究［1-2］证实蛋白激酶c(protein kinase c, pkc)可调控多种促炎因子（il1,il12,tnf和nfκb等）的活化，测定血清il12水平能预测sap的预后，对其早期诊断具有重要意义［3］. 我们采用免疫组织化学法和rtpcr法测定pkc在sap中的表达水平，以探讨pkc在sap中的作用机制，为临床诊治sap提供依据.
1材料和方法
1.1材料清洁级sd大鼠96只（雌雄各半），体质量220～260 g，（甘肃省中医学院实验动物中心），实验前12 h禁食，自由饮水. 牛黄胆酸钠(美国sigma公司)；一步法总rna提取试剂trizol(美国invitrogen公司)；一步法反转录聚合酶链式反应(rtpcr)试剂盒（大连宝生物公司）；即用型 sabc免疫组化染色试剂盒，兔抗 pkcα，鼠抗 pkcδ和dab显色试剂盒(武汉博士德公司).
1.2方法
1.2.1实验分组96只sd大鼠随机分为假手术(sham operation，so)组、轻型急性胰腺炎（mild acute pancreatitis，map）组和sap组，每组动物32只.
1.2.2模型制作map组大鼠术前禁食12 h，自由饮水,戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔麻醉,无菌条件下上腹正中切口进腹,于十二指肠内侧见片状分布的胰腺,肝门部胆胰管用无损伤动脉夹夹闭,从胆胰管开口十二指肠系膜缘对侧肠壁穿刺插入导管,导管进入肠腔后对准膨大壶腹中心插入胆胰管约1 cm,用微量泵以0.1 ml/min速度推注20 ml/l牛磺胆酸钠1 ml/kg,推注完毕后无损伤动脉夹夹闭胰胆管壶腹部观察10 min后拔管,去除动脉夹,缝合十二指肠穿刺口并关腹. sap组用微量泵以0.1 ml/min速度推注50 ml/l牛磺胆酸钠1 ml/kg, 其余步骤同map组. so组开腹仅轻轻翻动胰腺，关腹后皮下注射40 ml/kg生理盐水.
1.2.3取材和评分各组动物在建模后于 1，6，12和24 h四个时间点，（各时间点8只动物）以戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，经原切口入腹，无菌条件下取胰腺和肺脏，分别保存于40 g/l甲醛及-80℃冰箱，按 文献 ［4］的方法，由病理医师对大鼠胰腺及肺脏组织在光镜下按水肿、出血、感染和坏死四方面的轻重程度进行盲法病理评分.
1.2.4免疫组织化学染色切片脱蜡至水，ph 6.0的枸橼酸盐缓冲液微波抗原修复，室温下3 g/l h2o2孵育30 min，山羊血清封闭背景，加兔抗 pkcα多克隆抗体及鼠抗 pkcδ mab（1∶50） 4℃过夜，滴加二抗 37℃孵育1 h，加链酶亲和素生物素过氧化物酶复合物，室温孵育1 h，dab显色，苏木素复染细胞核，乙醇脱水. 阴性对照以 pbs代替一抗.1.2.5rtpcr检测取组织100 mg匀浆后加入1 ml总rna提取试剂，抽提组织总rna，紫外分光光度仪测定标本rna纯度，以甘油醛3磷酸脱氢酶（gapdh）为内参照扩增 pkcα及 pkcδ. 所有引物均由上海生物工程公司合成，pkcα引物序列: 上游5′gggatgaaatgcgacacc 3′，下游 5′ctctgagacgccgaagga 3′, 退火温度 56℃，共循环30次，产物长度300 bp；pkcδ引物序列：上游5′ctgtggcactttgctctg 3′下游 5′ttctgggtcacttggttc 3′退火温度 54℃，共30个循环，产物长度 153 bp；内参照 gapdh引物序列：上游 5′tacagatcacgaaagcatagagga 3′下游 5′tccattcgttcctgaacagcgaca 3′退火温度 54℃，共30个循环，产物长度411 bp；取rtpcr扩增产物4 μl,加上样缓冲液1 μl，在15 g/l琼脂糖凝胶上电泳，电泳条件为电压100 v, 60 min，凝胶图像分析系统分析，以目的基因与内参照gapdh产物比值代表该样品pcr产物的相对含量.
统计学处理：采用spss11.5统计软件进行数据的统计分析，各组计量资料以x±s表示，组间比较用单因素方差分析，p<0.05为差异具有统计学意义.
2结果
2.1大鼠胰腺和肺脏组织中pkc阳性细胞的表达so组中可偶见pkcα和pkcδ阳性细胞，且主要在细胞浆中表达. map组pkcα和pkcδ阳性细胞在胰腺和肺泡胞浆及胞膜中均有表达. sap组pkcα和pkcδ在胰腺及肺泡细胞膜中表达均呈强阳性. sap组1，6，12和24 h四个时间点pkcα表达分别为 766.00±9.79，799.13±12.80，821.38±15.81和816.13±24.48；pkcδ表达分别为747.14±10.23，775.91±14.30，797.50±11.32和794.35±14.71，较 so组明显升高，而map组低于 sap组，三组各时间点差异均具有统计学意义（p<0.05）. map组中pkcα和 pkcδ于6 h开始升高，12 h达到高峰，此后有所下降. sap组 pkcα和 pkcδ于1 h即开始升高，12 h达到高峰(图1，2).
2.2pkcα mrna，pkcδ mrna的表达水平结果显示，rtpcr所得到的pkcα，pkcδ和 gapdh产物长度分别为pkcα 300 bp，pkcδ 153 bp和gapdh 411 bp. pkcα mrna和pkcδ mrna表达量map组高于 so组，sap组高于map组，三组间各时间点差异具有统计学意义（p<0.05，表 1，图3).
a： so组； b： map组； c： sap组.
图124 h pkcα在大鼠胰腺中的表达sabc ×400（略）
a： so组； b： map组； c： sap组.
图224 h pkcδ在大鼠肺脏中的表达sabc ×400（略）
表1rtpcr法检测胰腺中pkcα mrna，pkcδ mrna表达（略）
ap<0.05, bp<0.01 vs so; dp<0.01 vs map. so: 假手术; map: 轻型急性胰腺炎; sap: 重症急性胰腺炎.
m: marker； 1～4: so组1,6,12,24 h； 5～8: map组1,6,12,24 h； 9～12: sap组1,6,12,24 h. a: 各组胰腺组织中pkcα和gapdh的rtpcr产物电泳结果； b: 各组胰腺组织中pkcδ和gapdh的rtpcr产物电泳结果.
图3各组胰腺组织中的rtpcr产物电泳图（略）
3讨论
pkc调控炎症因子的作用近年来逐渐受到重视. lallena等［5］ 研究 发现在静息细胞内,pkc与iκb激酶相结合,pkc是iκb激酶的直接激活剂,推测pkc很可能激活iκb的激酶,后者使iκb磷酸化而与nfκb解离,同时激活nfκb. pkc在tnfα信号转导中起关键作用, tnfα可通过磷脂酶产生脂质第二信使,并引发一系列信号转导. 刘刚等［6］发现急性胰腺炎患者血中pkc的水平明显较对照组增高，这与我们的研究结果相一致. miriam horovitzfried的研究指出抑制pkcδ会减少iκb的磷酸化和nfκb的激活，进一步减少炎症因子的释放，而且 pkcα可以 影响 pkcδ的表达［7］. 我们的实验结果提示，在造模后各组间 pkcδ变化略慢于pkcα，强度上也弱于 pkcα,我们推测pkcδ可能在sap发病的早期过程中并不起主要作用. 我们观察到sap组pkcα的激活较早，而且24 h仍维持较高水平，map组pkcα在12 h才开始升高，且活性变化有自限性. 据此我们推测: map早期pkcα不激活或者激活很少，从而不会引发sirs反应，在sap发生早期，大量激活的pkc引起炎症因子的级联瀑布效应导致全身感染是sap患者死亡的主要原因. 因此，pkcα的监测可以较早的反映sap病程的进展，pkcα或许可以成为sap早期诊断的指标. 另外，pkc抑制剂在一些炎症性疾病中起 治疗 作用，有研究［8］表明蛋白激酶抑制剂可以减轻重症胰腺炎肺损伤程度，这些可能与pkc对中性粒细胞的调节相关联. 有关抑制pkc是否有治疗重症胰腺的作用有待进一步研究.
【 参考 文献 】
［1］ 王孝养，熊维宁，徐永健，等. 核因子κb和蛋白激酶c对哮喘th类细胞因子表达的调控［j ］. 中华结核和呼吸杂志，2001, 24(6): 355-359.
［2］ tando y, algul h , wagner m, et al. caeruleininduced nfkappa b/rel activation requires both ca2+ and protein kinase c as messengers［j］. am j physiol, 1999, 277:678-686.
［3］ 马东瑞，李伟，张晓华，等. 白介素il2与大鼠急性坏死性胰腺炎严重程度的关系［j］. 第四军医大学报，2005,26(20):1885-1887.
［4］ 秦兰芬，吴建新，袁耀宗，等. 大鼠急性坏死型胰腺炎病理特征评定 方法 的研究［j］.
