作者：姜习新，张鹏辉，涂植光，杨毅，刘靳波
【摘要】 目的：体外 研究 sirnaegfphtert/u6ptzu6+1表达载体在肿瘤细胞中的靶向性. 方法 ：常规培养稳定表达绿色荧光蛋白的肝癌smmc7721细胞株（egfp7721）和稳定表达绿色荧光蛋白的人正常成纤维细胞株helf（egfphelf）. 以ptzu6+1质粒转染egfp7721细胞和egfphelf细胞为空白质粒组，sirnaegfpptzu6+1质粒转染egfp7721细胞和egfphelf细胞为实验对照组，将sirnaegfphtert/u6ptzu6+1质粒转染egfp7721细胞和egfphelf细胞作为实验组，用realtime sybr green pcr和western blot鉴定sirnaegfphtert/u6ptzu6+1对两种细胞株的绿色荧光蛋白表达的 影响 . 结果：正向和反向的重组质粒sirnaegfphtert/u6ptzu6+1转染egfphelf细胞与空白质粒比较，egfp 基因表达无差异（p＞0.05）, 而转染稳定表达绿色荧光蛋白的7721后仅反向的sirnaegfphtert/u6ptzu6+1重组质粒抑制egfp基因的表达（p＜0.01）. sirnaegfpptzu6+1质粒与空白质粒组比较，在 egfp7721和 egfphelf细胞株间，egfp基因的表达均具有统计学差异（p＜0.01）. 结论：反向插入的sirnaegfphtert/u6ptzu6+1重组质粒在肿瘤细胞具有一定靶向性，为进一步探讨基因的靶向 治疗 奠定了基础.
【关键词】 端粒酶逆转录酶；启动子；sirna表达载体; 靶向性
【abstract】aim: to study the tumortargeting potential of sirnaegfphtert/u6ptzu6+1 expression vector in vitro. methods：hepatocellular carcinoma cell smmc7721 and human normal fibrocytes helf, both expressing fluorescence protein (egfp7721, egfphelf) stably were cultured. the cells transfected with plasmid ptzu6+1, sirnaegfpptzu6+1 and sirnaegfphtert/u6ptzu6+1 were employed respectively as the empty vector groups, experimental control groups and experimental groups. realtime sybr green pcr and westernblot were applied to investigate the differential influences of plasmid sirnaegfphtert/u6ptzu6+1 on the egfp gene expressions in egfp7721 and egfphelf cells. results：the results of realtime sybr green pcr and western blot showed that there was no significant difference in the egfp gene expression between the recombinant plasmid sirnaegfphtert/u6ptzu6+1 (either oppositely or positively inserted) and the empty vector transfected egfphelf cells. on the contrary, only the opposited inserted sirnaegfphtert/u6ptzu6+1 recombinant plasmid inhibited the egfp gene expression in the egfp7721 cells (p＜0.01). as compared with the empty plasmid, the plasmid sirnaegfpptzu6+1 significantly inhibited the egfp gene expression in both egfp7721 and egfphelf cells (p＜0.01). conclusion: the oppositely inserted recombinant plasmid sirnaegfphtert/u6ptzu6+1 has the ability to target the malignant tumor cells, which provides the foundation for tumor genetargeted therapy．
【keywords】 htert; promoter, combining promoter; sirna expression vector; target
0 引言
端粒酶在多种恶性肿瘤细胞中高表达，正常细胞中除生殖细胞和造血细胞等外大多无或低表达［1］. 人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase, htert)是端粒酶活性的主要调控因子，对细胞的恶性转化、肿瘤的发生 发展 意义重大［2］. 现已有使用htert启动子作为靶向治疗引导物，对肿瘤进行了靶向基因治疗的研究［3］. 但和所有的肿瘤基因治疗一样，靶向性仍不理想. 本研究将htert/u6嵌合启动子的sirna表达载体，分别转染表达htert的肝癌细胞株smmc7721和htert阴性的人正常成纤维细胞株helf，以探讨sirnaegfphtert/u6ptzu6+1质粒在肿瘤细胞中靶向性和有效性.
1 材料和方法
1.1 材料 gfp抗体购自中山公司，sybr○rexscripttmrtpcr和primescripttm rt reagent kit，rtaq酶、rna提取试剂盒和pmd18t载体均购自takara 公司. 针对绿色荧光蛋白基因(egfp)的含htert/u6嵌合启动子的sirna 表达载体(sirnaegfphtert/u6ptzu6+1)和针对绿色荧光蛋白(egfp)的sirna表达载体(sirnaegfpptzu6+1)为本课题组以前构建, 其中sirnaegfphtert/u6ptzu6+1重组质粒根据htert核心启动子插入u6启动子方向不同，有正向和反向重组质粒之分. 引物由上海生物有限公司合成. lightgen hrp kit购自维奥基因发展有限公司. 稳定表达egfp的肝癌细胞株smmc7721为本课题组以前构建. 人正常成纤维细胞株helf购自南京凯基生物有限公司. lipofectamine质粒转染试剂购自invitroge公司. 人正常成纤维细胞株helf购自南京凯基生物技术有限公司. 化学发光成像仪abi7000（维奥基因发展有限公司，宁波）.
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 稳定表达egfp的7721细胞和人正常成纤维细胞helf培养于含有100 ml/l小牛血清的dmem培养基内，在50 ml/l co2，37℃条件下，培养2～3 d后，用2.5 g/l胰酶消化，传代1次.
1.2.2 构建稳定表达绿色荧光蛋白的人正常成纤维细胞株helf 6孔板上的helf长满到7/10时，240 μl血清dmem中加入4 μg egfp质粒. 将250 μl的dna脂质体混合物加入用无血清dmem清洗3遍的6孔板中，加无dmem至2 ml. 50 ml/l co2，37℃培养4～5 h后，换成有血清的dmem继续培养. 筛选 24 h 后观察荧光，g418（800 mg/l）筛选15 d. 单克隆细胞株的构建:将筛选后转染egfp的helf细胞用胰酶消化后离心、计数，稀释成5000个/l，96孔板每孔加入200 μl, 50 ml/l co2，37℃ 条件下培养.
1.2.3 转染 将稳定表达egfp的单克隆细胞株smmc7721和helf传至6孔板，按1×108个/l的密度分别传3孔. 将ptzu6+1质粒分别转染稳定表达egfp的7721和helf为空白质粒组, 将sirnaegfpptzu6+1质粒分别转染稳定表达egfp的7721和helf作为实验对照组，将sirnaegfphtert/u6ptzu6+1质粒分别转染稳定表达egfp的7721和helf作为实验组，质粒(4 μg)与脂质体(16 μl)比例为1∶4，24 h后用荧光显微镜观察荧光. 待每孔长满后传至另外两块6孔板上的两孔中，继续培养至长满.
1.2.4 合成cdna 将其中的一块转染后长满细胞的6孔板提取rna，rna凝胶电泳鉴定后，进行rt反应. 反应条件如下: 37℃ 15 min，85℃ 5 s.
1.2.5 标准品的制备 将cdna经pcr扩增，pcr产物胶回收后与pmd18 t载体相连（步骤见说明书），挑取出阳性克隆测序. 用紫外分光光度仪测量提取的质粒(要求a260nm/a280nm为1.7～2.0，并估算dna的含量)，浓度为0.236 g/ l.
1.2.6 sybr○rexscripttmrealtime荧光定量 pcr ①egfpc1基因引物 p1：5′cgtccatgccgagagtgatc3′, p2：5′ccgacaaccactacctgagc3′；内参引物5′caattccctccaaaatcaagtg3′， 5′gcagagggggcagagatga3′. 产物长度分别为108 bp和156 bp. ②根据合成标准品的浓度，算出起始ct值. ct=c/b×6.02×1014，式中c为浓度(g/l)，b为分子质量（mr）. 根据公式算出标准品ct=1.54×1010. ③用easy dilution 稀释标准品，以1×107, 1×106, 1×105, 1×104, 1×103, 1×102和1×101 浓度制作标准曲线. ④反应条件：95℃ 10 s，95℃ 5 s，60℃ 31 s，40个循环. ⑤制作融解曲线，确定反应物的单一性；并将不同浓度的定量模板的对数和相应ct值作图，绘制标准曲线. 根据标准曲线 计算 样品cdna浓度. 所有标本均重复检测3次，并用sds2.2图像定量 分析 软件进行数据处理.
1.2.7 western blot检测绿色荧光蛋白的表达 将转染后7721细胞和helf细胞的蛋白质抽提液分别加入4体积5×蛋白上样缓冲液，十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(上样量25 mg). gfp蛋白mr为27×103，nadph蛋白mr为43×103. 半干转膜仪转移至pvdf膜，膜与封闭液4 ℃封闭过夜；pvdf膜分别与兔抗水母的gfpigg (1∶200)、gapdh(1∶500)mab(终浓度2 mg/l) 37℃孵育2 h后，将膜移入羊抗兔igghrp二抗中，37℃孵育2 h，用ecl化学发光系统检测，待条带清楚显示后终止反应. 显色的pvdf膜通过凝胶成像系统行灰度扫描.
统计学处理：所有检测实验均重复3次，数据以x±s表示，使用spss11.5统计软件进行t检验，p＜0.05认为差异有统计学意义.
2 结果
2.1 sirnaegfphtert/u6ptzu6+1嵌合启动子转染稳定表达绿色荧光蛋白的smmc7721后的荧光变化 正向sirnaegfphtert/u6ptzu6+1重组质粒转染至egfp7721和egfphelf细胞株后，干扰效果与空白质粒组相比，荧光表达无明显变化；反向sirnaegfphtert/u6ptzu6+1重组质粒转染egfp7721和egfphelf细胞株后，egfp7721细胞株与空白组相比荧光表达明显下降，但其与转染sirnaegfpptzu6+1重组质粒相比，其荧光的表达要稍强，而egfphelf细胞株荧光表达无变化；sirnaegfpptzu6+1重组质粒转染egfphelf和egfp7721细胞后荧光表达明显下降（图1）.a1，b1：egfp7721和egfphelf细胞转染空白质粒组；a2，b2：egfp7721和egfphelf细胞转染正向插入端粒酶逆转录酶核心启动子的sirnaegfphtert/u6ptzu6+1重组质粒后荧光表达；a3，b3：egfp7721和egfphelf细胞转染反向插入端粒酶逆转录酶核心启动子的sirnaegfphtert/u6ptzu6+1重组质粒后荧光表达；a4，b4：egfp7721和egfphelf细胞转染sirnaegfpptzu6+1重组质粒的荧光表达.
图1 转染质粒后egfp7721和egfphelf细胞的荧光变化（略）
2.2 标准曲线的绘制 荧光定量rtpcr的样本和内参标准品cdna的起始浓度的对数值与ct值成一直线，且重复性好，样本的斜率(slope)接近-3.018，r=0.9981内参的斜率(slope)接近-3.157，r=0.998.
2.3 pcr产物的定量 分析 由图2融解曲线分析显示，egfp和nadph基因pcr产物的融解曲线峰值分别为87.5℃和85.7℃，融解温度均一，峰的形状也较锐利. 表明egfp和nadph的pcr产物特异，无杂带.用标准曲线定量法以标本检测所得egfp拷贝数和对应的内参基因gapdh基因拷贝数比值进行标准化，对egfp进行绝对定量. 在egfp7721细胞中，转染ptzu6+1egfpsirna，反向sirnaegfphtert/u6ptzu6+1重组质粒组与转染ptzu6+1空白质粒组相比均显著下调(p<0.05，n=3)；转染正向sirnaegfphtert/u6ptzu6+1质粒组与空白质粒组比，差异无统计学意义(p＞0.05，n=3). 而在egfphelf细胞株中，仅ptzu6+1egfpsirna质粒与未转染质粒组相比，gfp基因下调(p<0.05，n=3)；而正向、反向重组质粒与空白质粒组比较均无差异(均p>0.05，n=3). 说明反向重组质粒仅对htert阳性表达的egfp7721细胞起作用，而对htert阴性表达的egfphelf细胞无明显作用.
2.4 western blot 结果表明，反向插入的重组质粒sirnaegfphtert/u6ptzu6+1仅在htert高表达的egfp7721细胞中发挥作用，而对于htert阴性表达的egfphelf细胞则无明显作用. 在egfp7721细胞中，转染重组质粒sirnaegfphtert/u6ptzu6+1与转染质粒 ptzu6+1egfpsirna相比，gfp蛋白表达存在差异（图3，表1）.
a: egfp基因； b: nadph基因.
图2 荧光定量pcr产物的融解曲线（略）
a：egfp7721细胞；1, 2：转染sirnaegfpptzu6+1； 3：转染空白质粒ptzu6+1质粒； 4：转染正向插入的sirnaegfphtert/u6ptzu6+1； 5：转染反向插入的sirnaegfphtert/u6ptzu6+1重组质粒；6：未转染质粒的空白对照. b：egfphelf细胞；1：未转染质粒的空白对照； 2：转染空白质粒ptzu6+1 质粒；3：转染反向插入的sirnaegfphtert/u6ptzu6+1重组质粒； 4：转染正向插入的sirnaegfphtert/u6ptzu6+1重组质粒；5：转染sirnaegfpptzu6+1质粒.
图3 western blot结果（略）
表1 不同质粒转染对gfp蛋白表达的 影响 （略）
a p<0.05 vs 反向sirnaegfphtert/u6ptzu6+1组；d p<0.01 vs ptzu6+1组.
3 讨论
理想的sirna表达载体导入 方法 是把作为药物 应用 的sirna集中导入到需要进行基因沉默的靶器官细胞内，避免进入不需要进行基因沉默的“无辜组织细胞” ［4］. 但是与其他类型的药物一样，在体内sirna分子自身并不能选择目标细胞［5］. 本 研究 中选择的ptzu6+1质粒中的u6启动子虽有一定肿瘤细胞靶向性，但特异性却不高. 最近，研究者们利用端粒酶逆转录酶htert启动子引导自杀基因，在端粒酶阳性的肝癌、肺癌中导致肿瘤细胞的死亡，明显抑制肿瘤的生长［6］. 也有人将htert启动子反向插入腺病毒载体，构建htert启动子调控的含化疗药物基因的腺病毒表达载体［7-8］，启动效率高，可达到t7噬菌体启动子的高效启动水平. 因此，本研究中前已构建的sirnaegfphtert/u6ptzu6+1重组质粒就是将htert启动子插入u6启动子的上游而成.
本研究中选取了htert高表达的肝癌细胞株smmc7721和htert几乎无表达的人正常的成纤维细胞株helf，将重组质粒sirnaegfphtert/u6ptzu6+1转入这两株细胞验证其靶向性，以保证实验目标的针对性；构建其稳定表达绿色荧光蛋白的单克隆细胞株，则保证了目的基因的高表达性；而ptzu6+1质粒因其不表达绿色荧光蛋白，将其作为egfp的sirna的表达载体则可在荧光显微镜下直接观察sirnaegfphtert/u6ptzu6+1重组质粒的干扰效果.
在本研究中，通过western blot和fqpcr从蛋白和mrna水平鉴定sirnaegfphtert/u6ptzu6+1重组质粒干扰效果发现，仅反向插入的htert启动子重组质粒才有干扰效果，而在端粒酶阴性的helf细胞中，正向和反向重组质粒均无干扰效果，这和设想一致. 但是还发现反向sirnaegfphtert/u6ptzu6+1重组质粒的干扰效果比sirnaegfpptzu6+1重组质粒的干扰效果稍差，是否与两个启动子之间的相互作用有关有待研究. 另外，由于我们只选择了htert高和无表达的两株代表性细胞，无中度表达的细胞株,因此，我们将进一步的观察并分析对不同类型肿瘤细胞的靶向性，为动物实验和基因的靶向 治疗 奠定可靠基础.
【 参考 文献 】
［1］ saldanha sn, andrews lg, tollefsbol to, et al. analysis of telomerase activity and detection of its catalytic subunit htert ［j］. analyt biochem, 2003, 315(1):1-21.
［2］ li lr，wan ds，pan zz，et al. clinical significance of human telomerase reverse transcriptase in patients with colon cancer ［j］．ai zheng，2004，23(11 suppl 1):1502-1507.
［3］ fujiwara t, urata y, tanaka n, et al. telomerase specific oncolytic virotherapy for human cancer with the htert promoter ［j］. curr cancer drug targets, 2007, 7(2):191-201.
［4］ gewirtz am. on future′s doorstep: rna interference and the pharmacopeia of tomorrow ［j］. clin invest, 2007, 117(12):3612-3614.
［5］ li cx, parker a, menocal e, et al. delivery of rna interference ［j］. cell cycle,2006, 5(18):2103-2109.
［6］ painter rg, lanson na jr, jin z, et al. conditional expression of a suicide gene by the telomere reverse transcriptase promoter for potential posttherapeutic deletion of tumor genesis［j］. cancer sci, 2005, 96(9):607-613.
［7］ fujiwara t, kagawa s, kishimoto h, et al. enhanced antitumor efficacy of telomeraseselective oncolytic adenoviral agent obp401 with docetaxel: preclinical evaluation of chemovirotherapy［j］. int j cancer, 2006，15, 119(2):432-440.
［8］ davis jj, wang l, dong f, et al. oncolysis and suppression of tumor growth by a gfpexpressing oncolytic adenovirus controlled by an htert and cmv hybrid promoter ［j］. cancer gene the r, 2006, 13(7):720-723.
