【摘要】 目的 研究异丙肾上腺素(iso)诱导的心力衰竭大鼠心肌细胞端粒酶逆转录酶(tert)的表达意义。方法 健康清洁级sd大鼠20只，随机分为对照组及心力衰竭模型组（iso组）各10只，对照组腹腔注射生理盐水2 ml·kg-1，iso组腹腔注射iso 30 mg·kg-1，均每日1次，连续2 d，给药结束观察48 h。检测大鼠血清肌酸激酶(ck)、乳酸脱氢酶(ldh)水平，计算心脏系数，同时检测心肌细胞超氧化物歧化酶(sod)活性和丙二醛(mda)水平；应用western blotting方法检测tert蛋白表达的变化；利用免疫组织化学方法检测tert蛋白在心肌细胞中的定位。结果 与对照组比较，iso组大鼠血清ck、ldh明显升高（p<0.01），心肌坏死程度加重，心脏系数也显著增加（p<0.01）；iso组大鼠心肌细胞mda明显升高（p<0.05），sod活性显著下降（p<0.01）；对照组心肌细胞未见tert蛋白表达，iso组大鼠心肌细胞tert蛋白表达明显增加，免疫组织化学实验结果显示iso组大鼠心肌细胞浆中和胞核内有tert阳性免疫产物生成。结论 心力衰竭大鼠心脏存在心肌细胞增殖，心肌细胞增殖对心功能有代偿作用。
【关键词】 异丙肾上腺素；心力衰竭；端粒酶逆转录酶；心肌细胞 基金项目：河南省教育厅立项课题（编号：200510472003）
expression of telomerase reverse transcriptase in myocardial cell of rats with heart failure
zhang guang-mou，zhang yan-fen，xu chong-jie，et al
(department of cell biology and genetics，xinxiang medical college，xinxiang 453003，china)
abstract: objective to research the expression of telomerase reverse transcriptase(tert) in myocardial cell of rats with heart failure induced by isoprenaline（iso）.methods twenty healthy rats were randomly divided into control group and heart failure model group（iso group）．the rats in control group were given normal saline(2 ml·kg-1) by intraperitoneal injection,and iso(30 mg·kg-1) was used in iso group,once a day,for 2 days.serum creatine kinase(ck),lactate dehydrogenase(ldh),cardiac index,superoxide dismutase(sod) activity and malondialdehyde(mda) were detected.tert protein was determined by western blotting,and the localization of tert in myocardial cell was determined by immunohistocheminstry.results compared with control group，ck,ldh and cardiac index were higher（p<0.01）,the degree of heart muscle necrosis aggravated.the contents of mda in myocardial cell increased obviously（p<0.05），the activity of sod descended significantly.the tert expression of myocardial cell was not obversed in control group,but the expression increased obviously in iso group.positive immunohistochemical staining of tert was located in the nucleus and cytoplasm of myocardial cell in iso group.conclusion there is myocyte proliferation in the rats with heart failure.myocyte proliferation play compensatory role in heart function.
key words: isoprenaline；heart failure；telomerase reverse transcriptase；myocardial cell
端粒(telomere，tm)是细胞染色体末端的一段重复dna序列，其功能是维持染色体的稳定性。wWw.11665.cOM在细胞生长周期中，dna复制1次，tm就会损失一小部分，因而tm决定了细胞分裂的次数及寿命［1］。端粒酶属于一种反转录酶，可以自身rna为模板特异合成端粒dna，保护染色体的末端［2］。近年来，关于tm和端粒酶的研究方兴未艾，尤其是它们与细胞凋亡、癌症发生的关系倍受重视，而关于tm和端粒酶在心血管疾病中的作用研究较少。本研究拟观察端粒酶逆转录酶(telomerase reverse transcriptase，tert)在心力衰竭大鼠心肌细胞中的表达意义，以探讨端粒酶活性与心肌细胞分裂的关系，为心血管疾病的治疗提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物 健康清洁级sd大鼠，雌雄不限，体质量为(198.0±26.2)g。由新乡医学院实验动物中心提供。
1.2 主要试剂 异丙肾上腺素（isoprenaline，iso）(sigma公司，美国)；兔抗tert多克隆抗体 (santa cruz公司，美国)；sp免疫组织化学试剂盒(北京中杉生物工程有限公司)；碱性磷酸酶标记山羊抗兔igg(北京中杉生物工程有限公司)；pvdf膜（pall corporation,美国）；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，bsa，上海生工生物有限公司），nbt/bcip显色试剂盒(sigma公司，美国)；肌酸激酶(creatine kinase，ck)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，ldh)、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，sod）、丙二醛（malondialdehyde，mda）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）。
1.3 方法
1.3.1 大鼠心力衰竭模型的建立 健康清洁级sd大鼠20只，随机数字表法分为对照组和心力衰竭模型组（iso组）各10只，对照组腹腔注射生理盐水2 ml·kg-1，iso组腹腔注射iso 30 mg·kg-1，均每日1次，连续2 d，给药结束观察48 h。各组观察结束后麻醉，眼球处采血，静置取血清。处死大鼠，取出心脏称重,置于冰盐水中洗涤数次至无血迹，切取左心室（含室间隔）称重,沿左心室最宽处垂直于长轴将其分成2部分切取心肌标本2块，标记后1块置于oct冰冻切片包埋剂包埋，冰冻切片机（leica cm3050s，徕卡仪器有限公司，德国）连续切片，片厚5 μm，备形态学研究；另1块置于液氮罐中保存备用。
1.3.2 心肌组织病理学分析 切片于苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，he）染色后观察其组织病理性损伤改变。
1.3.3 心脏系数与ck、ldh的测定 电子天平准确称量全心湿重，计算心脏系数(全心湿重/体质量，mg·g-1)。按试剂盒说明书使用jh-752紫外可见分光光度计（上海箐华科技仪器有限公司），比色法检测血清ck、ldh含量。
1.3.4 心肌组织sod、mda的测定 心肌sod活性检测采用黄嘌呤氧化酶法，mda含量采用硫代巴比妥酸法测定，严格按试剂盒说明书进行。结果使用jh-752紫外可见分光光度计测定。
1.3.5 免疫组织化学检测心肌tert 一抗为兔tert多克隆抗体(150稀释)，严格按照sp试剂盒说明书操作，以pbs代替一抗作阴性对照，dab显色，苏木素复染。每只大鼠取4张切片，光镜下观察阳性细胞，tert以胞浆及细胞核出现棕黄色颗粒为阳性。心肌细胞间隙连接蛋白-43作阳性对照。
1.3.6 western blotting蛋白印迹分析 参照文献描述的方法［3］，取液氮冻存的心肌标本100 mg加入生理盐水碾磨后移入1.5 ml ep管中，4 ℃ 12 000 r·min-1离心20 min，取上清液，考马斯亮兰法进行蛋白定量。各取等量的心肌碾磨上清液进行sds聚丙烯酰胺电泳，分离后将蛋白质电转移到pvdf膜上。20 g·l-1 bsa 37 ℃封闭pvdf膜1 h，加兔抗tert多克隆抗体(1800) 4 ℃过夜，加碱性磷酸酶标记山羊抗兔igg(11 000)37 ℃孵育1 h，nbt/bcip暗室显色5 min。β-actin作为内参照。
1.4 统计学处理 各组实验数据以均数±标准差(x±s)表示，组间差异的显著性检验用t检验。
2 结果
2.1 病理形态学观察 大鼠心肌组织切片he染色，发现对照组心肌细胞染色均匀，心肌纤维排列整齐，横纹清楚。iso组心肌细胞染色不均，心肌纤维走向紊乱，细胞大小不均，较对照组心肌细胞直径明显变大，细胞密度变小，毛细血管密度减少，细胞间质增多，细胞间距变大。
2.2 大鼠心脏系数及血清ck、ldh含量比较 iso组心脏系数及血清ck、ldh含量与对照组比较均有明显增加（p<0.01）。见表1。
表1 2组大鼠心脏系数、血清ck、ldh含量比较（略）
tab.1 comparison of cardiac indexes,serum ck and ldh content of rats between two groups
与对照组相比ap<0.01
2.3 大鼠心肌sod活性和mda水平 iso组sod与mda含量分别为（11 286±3 162）u·g-1，（2 483±436）nmol·g-1；对照组sod与mda含量分别为（19 242±3 454）u·g-1，（1 796±325）nmol·g-1，2组比较，iso组大鼠心肌细胞mda含量明显升高（p<0.05），sod活性显著下降（p<0.01）。
2.4 心肌细胞tert表达与分布 免疫组织化学检测对照组未见心肌细胞中tert的表达；iso组部分心肌细胞胞质tert呈阳性表达，少部分可见细胞核阳性表达；iso组血管内皮细胞、成纤维细胞胞质和胞核呈阳性表达。免疫印迹法检测心肌组织，对照组未见心肌细胞中tert的表达；iso组心肌细胞tert的表达明显增加，见图1。
对照组 iso组 iso组
图1 对照组和iso组中心肌细胞tert免疫印迹（略）
fig.1 protein expression of tert in myocardium in control group and iso group by western blotting
3 讨论
iso为β受体激动剂，作用于心脏β1 受体，使心肌收缩力增强，心率加快，传导加速，心输出量和心肌耗氧量增加［4］。大剂量iso可引起心肌细胞坏死，可作为体内诱导心肌坏死动物模型建立的药物。iso诱发心脏损伤的机制还不是很明确，目前的研究资料显示，氧化应激、细胞内钙稳态失调、诱导细胞凋亡等可能是其重要的诱发因素。ldh是细胞内标志性酶，其化学和生物性质十分稳定，通常情况下ldh的漏出很少［5］,心肌中含有丰富的ck、ldh，心肌受损时可大量进入血液，因而可以通过检测血清中ck、ldh含量，诊断其心脏受损情况；心肌损伤时心脏系数可增大，因此可应用心脏系数指标辅助评价心肌受损情况［6-7］。本实验中腹腔连续给予大剂量异丙肾上腺素可引起血清中ck、ldh升高，心脏系数也明显增加，说明有心肌损伤发生，心脏病理学检查亦发现心肌出现明显坏死，进一步证明心肌受损模型建立成功。
正常情况下机体能形成少量氧自由基和活性氧，过多的活性氧可通过脂质过氧化途径损伤细胞，mda是脂质过氧化反应的代谢产物，反映了组织过氧化损伤的程度［8-10］，通过检测组织mda含量可以反映该过程的强弱［11-12］。sod是机体主要抗氧化酶,是清除细胞内自由基,保护细胞免受氧化应激损伤的关键酶之一，sod活性的高低是衡量机体抗氧化能力大小的重要因素［13-14］,sod活性及mda水平间接反映了机体清除氧自由基的能力和细胞受自由基攻击的严重程度［15］。本实验中心力衰竭大鼠心肌匀浆中mda含量明显升高，sod活性明显降低，说明iso抑制了这些酶的活性，使心脏发生了严重的脂质过氧化反应，从而使心肌损伤加重。
tert为具有催化活性的端粒酶蛋白亚单位，其表达与端粒酶活性密切相关［16］。smogo-ewska等［2］提出在胎鼠和出生后早期，tm的缩短可以由端粒酶重新合成来补充；在以后的发育过程中，由于端粒酶的缺失，tm缩短，心肌细胞经历了衰老和激活自杀程序而凋亡。近年的研究中也发现胎鼠和胎儿的心肌细胞处于大量增殖阶段，出生后大部分心肌细胞退出有丝分裂，进入细胞体积增大阶段［17-18］。本研究发现，在正常大鼠的心肌细胞中未见tert的分布和表达，说明大鼠心肌细胞经过多次分裂tm缩短并且停止增殖而进入终末分化状态；心力衰竭大鼠显示了tert分布和蛋白表达，说明心力衰竭大鼠发生了心肌细胞代偿性增生，激活了部分心肌细胞的增殖能力。有实验证明，在心力衰竭末期心肌细胞增殖数明显高于正常心脏和缺血损伤初期，因此，心肌细胞增殖是导致心室重构的一个重要因素。总之，可望用人工手段暂时激活端粒酶，构建各种体外细胞库，对损伤或功能衰退的器官组织进行细胞移植，修补病变的器官组织。通过深入研究，可能会对心力衰竭、心肌梗死等心血管疾病的治疗产生深远的影响，提供更多的方法和思路。
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