作者：孙雅娟，刘鲁川，金岩，邓蔓菁，方军，陆伟，杨振华
【摘要】 目的: 研究 绿色荧光蛋白(gfp)转基因小鼠脂肪间充质干细胞(adsc)体外定向诱导下的多向分化潜能. 方法 ：取出生后4 d的gfp转基因小鼠腹股沟的皮下脂肪组织, 经过胶原酶消化，加入脂肪组织来源干细胞条件培养基中培养.将生长状态良好的第5代gfpadscs分别加入成骨及成脂条件培养液进行体外多向分化诱导研究. 并分别采用茜素红钙盐染色和油红o染色进行鉴定. 结果：成功获得了稳定表达gfp的adscs，gfpadsc经成骨诱导20 d后茜素红染色可见有橘红色钙盐沉积; 经成脂诱导10 d后油红o染色阳性. 结论：gfp作为报告基因在adscs分化过程中没有被关闭，亦未 影响 到ascs的多向分化潜能，是adsc在体多向分化研究的一个有效示踪工具.
【关键词】 绿色荧光蛋白; 转基因小鼠; 脂肪间充质干细胞; 多向分化潜能
【abstract】 aim: to study the multilineage potential of adipose tissuederived stromal cells (adscs) from transgenic mice with green fluorescent protein (gfp) gene. methods: adipose tissues were isolated from the groin region of a 4dayold gfp transgenic mouse, and incubated in a collagenase solution, then cultivated in conditioned culture medium to obtain gfpadscs. the passage 5 gfpadscs were induced to differentiate into osteoblasts, or adipocytes with solution of calcium induction medium or adipogenic medium respectively. after calcium induction, the alizarin red staining was performed to test the formation of calcium concentration. the adipoinduced mscs were detected with oil red o staining. results: adscs, stably expressing gfp, were obtained successfully from the transgenic mice with gfp gene. after 20 d calcium induction, jacinth calcium salts could be detected in the cells by alizarin red staining.at day 10 after being adipoinduced, the cells showed positive oil red o staining. conclusion: the gfp, as report gene, is not closed during the differentiation, and exerts no effect on the multilineage potential of adscs, which can be used as an efficient tracking facility for studying the mechanism of multilineage potential of the adscs in vivo.
【keywords】 green fluorescent protein; transgenic mice; adipose tissuederived stromal cells; multilineage potential
0 引言
脂肪组织来源干细胞(adipose tissue derived stem cells, adscs),由于来源广泛,取材方便,具有多向分化潜能，已成为近年组织工程学研究热点［1-2］. 有关其参与组织修复及重塑的在体研究逐年增多. 绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, gfp)转基因小鼠为寻求一种良好的示踪工具提供了一个很好的细胞来源［3］. 本研究在体外培养gfp转基因小鼠脂肪间充质干细胞(gfpadscs),探讨gfp的变化及其多向分化潜能， 为进一步在体研究adscs分化机制提供实验基础.
1 材料和方法
1.1 材料 出生4 d的gfp小鼠由第四军医大学口腔 医院 组织工程中心提供. d/f12培养基、胰酶、ⅰ型胶原酶(美国gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青犊牛 应用 研究所)；地塞米松、维生素c，吲哚美辛，ibmx, 胰岛素（美国sigma公司）.
1.2 方法
1.2.1 adscs的分离和培养 取gfp小鼠6只,引颈处死后750 ml/l乙醇消毒10 min,超净台内取腹股沟部脂肪组织,去除血管及其它组织,用含双抗0.1 mol/l pbs反复冲洗3次，用剪刀将脂肪组织剪成1 mm3小块,625万u/l的ⅰ型胶原酶,37℃消化50 min,加入两被体积的pbs，反复吹打，200 μm筛网过滤形成单细胞悬液,800 r/min离心5 min,弃去上层的脂肪及上清,再加入pbs液重悬细胞再次离心，反复2次，收集细胞并进行细胞计数,以1×106的密度接种于培养瓶中,陪养液含100 ml/l fbs, 0.1 mol/l neaa的d/f12（1∶1），置37℃ 50 ml/l co2培养箱中常规培养,原代2 d后换液,细胞长满80%时用胰酶消化传代培养.
1.2.2 adscs多向分化诱导 取生长状态良好的第5代gfpadsc, 2.5 g/l胰酶消化细胞,以5×107/l接种于放有玻片的6孔板内,第2日换用诱导液.
1.2.2.1 adscs成骨诱导 诱导液为地塞米松10 μmol/l, vitc 50 μmol/l, β磷酸甘油钠10 mmol/l, 含100 ml/l胎牛血清的d/f12.诱导液每周更换3次, 20 d后成骨诱导爬片进行茜素红染色, 40 g/l多聚甲醛固定1.5 h, pbs漂洗,然后浸入10 g/l硝酸银水溶液, 紫外光照射1 h,蒸留水冲洗尽量去除银汞液, 50 g/l硫代硫酸钠水溶液中浸2 min，自来水冲洗, 10 g/l中性红复染胞核30 s，乙醇脱水，二甲苯透明,树脂封片，然后显微镜下观察.
1.2.2.2 adscs成脂诱导 诱导液为地塞米松1 μmol/l, 吲哚美辛200 μmol/l, ibmx 0.5 μmol/l, 胰岛素10 mg/l, 含100 mg/l胎牛血清的d/f12. 成脂诱导10 d后，将其爬片进行油红o染色,40 g/l多聚甲醛固定45 min, pbs漂洗,油红o的工作液中浸15 min，蒸馏水洗25 min,苏木精复染15 min,自来水洗5 min,甘油明胶封固.然后显微镜下观擦.
2 结果
2.1 倒置显微镜观察 第2日细胞贴壁后,经过1次换液, 4～5 d细胞长满80%,倒置显微镜下可见细胞呈小多角形或短梭形,单核,有时突起较多，并存在一些多脂滴细胞. 经传代后多脂滴细胞减少, 脂肪干细胞突起减少, 并呈小多角形或短梭形, 生长较快, 倍增时间约24～28 h, 各代细胞形态无明显变化. 培养15代以后细胞的增殖速度无明显减慢. 前3～5代, 细胞内还有少量的前脂肪细胞, 细胞较大, 胞质内有大量脂肪颗粒, 5代以后细胞纯度好.在传代过程中未见形成自发钙结节, 也未见到向成熟脂肪细胞自发分化，而且绿色荧光轻度良好（图1）.
2.2 adscs成骨分化能力检测 脂肪组织来源的干细胞向成骨方向诱导过程中,细胞形态发生明显变化, 突触消失, 胞体增大, 形态近方形或多边形. 培养后20 d细胞呈聚集生长, 茜素红染色可见呈橘红色钙盐沉积，证实adscs成骨分化（图2）.
图1 第5代gfpadscs ×40（略）
图2 adscs成骨分化能力检测 茜素红染色 ×100（略）
2.3 adscs成脂分化能力检测 显微镜下观察结果显示， gfpadscs成脂诱导后形态发生变化,胞质内出现圆形空泡,并逐渐融合,油红o染色可见成红色的脂滴颗粒，证实adscs成脂分化（图3）.
图3 adscs成脂分化能力检测 油红o染色 ×100（略）
3 讨论
组织工程学的 发展 为解决人类组织器官的再生提供了可能.在种子细胞方面，干细胞作为具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞，有着非常重要的 理论 研究 意义和临床 应用 价值，是构建人工生物组织最理想的种子细胞［1］. 目前 应用于组织工程的干细胞来源主要有两种，即胚胎干细胞和成体干细胞，胚胎干细胞由于伦 理学 方面的压力国内外对其研究普遍持谨慎态度，故组织工程种子细胞的来源只能从成体干细胞的方面来考虑.而成体干细胞存在取材困难及获得率低等不利因素故应用也不多［1］.近年来发现adscs具有取材容易、获得率高、自我更新能力强及多向分化潜能等特点［2-5］.因此认为adscs也许会成为将来组织修复种子细胞的新来源. 然而在活体,要评价adscs进行细胞移植和/或与材料复合后的迁移定位等十分困难,尤其是在局部微环境诱导后, adscs向成骨方向分化,分化后细胞与宿主骨髓源细胞或骨膜形成的骨形成细胞难以区分,从而难以正确评价adscs的修复功能［6-7］.
荧光蛋白标记技术是近年来迅速发展的一种新型细胞示踪技术, 利用基因载体将荧光蛋白基因导入待标记细胞, 通过筛选获得表达荧光蛋白的细胞, 可通过荧光显微镜直接观察, 而不需反应底物［6］. 绿色荧光蛋白基因作为一种新型的报告基因, 具有高效、稳定、无毒、易于检测等特性, 能在活细胞中直观地观察其表达, 可较快筛选其修饰的细胞［7-8］, 被广泛用于移植干细胞在体内示踪等方面的研究.许多学者通过稳定或瞬时表达gfp标记细胞,但标记细胞的时效性难以确定,随着分化和报告基因水平降低,体外标记细胞的报告基因会关闭［9］.而转基因动物表达的报告基因普遍存在，体外扩增传代和体内分化不会导致报告基因的关闭. 因此可以提供直观、简便、稳定的标记细胞［10］.
本研究我们利用显性遗传的表达gfp的转基因小鼠作为细胞供体, 进行了adscs的分离和培养，成功获得了稳定表达gfp的小鼠adscs.并采用油红o和茜素红染色 方法 进一步证实，在不同的诱导条件下，其可分别向成脂和成骨方向分化.实验结果说明，gfp作为报告基因在adscs分化过程中没有被关闭，可作为良好的示踪因子；而且稳定表达的gfp未 影响 到adscs的多向分化潜能.本试验结果为利用gfp作为示踪基因，在体观察adscs作为种子细胞参与组织修复提过程供了实验基础.
【 参考 文献 】
［1］ pittenger mf, mackay a, beck sc, et al. multilineage potential of adult human mesenchymal stem edls［j］. science，1999，284(5411)：143-147.
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［3］ lippincottschwartz j, patterson gh. development and use of fluorescent protein markers in living cells［j］. science, 2003, 300(5616): 87-91.
［4］ cao y,sun z,liao l,et al. human adipose tissuederived stem cells differentiate into endothelial cells in vitro and improve postnatal neovascularization in vivo［j］. biochem biophys res commun, 2005, 332(2): 370-379.
［5］ rangappa s,fen c,lee eh,et al. transformation of adult mesenchymal stem cells isolated from the fatty tissue into cardiomyocytes［j］. amm thorac surg, 2003, 75(3):775-779.
［6］ mizuno h,zuk pa,zhu m,et al. myogenic differentiation by human processed lipoaspirate cells［j］. plast reconstr surg, 2002, 109(1): 199-209.
［7］ 段小军, 杨 柳, 周 跃, 等.增强型绿色荧光蛋白标记技术对骨折后骨髓间充质干细胞的迁移示踪［j ］.
