作者：刘学武,沈岚,张健,刘新平
【摘要】 目的：构建针对转录因子miz1基因的sirna表达载体，观察其 影响 hela细胞对阿霉素的敏感性. 方法 ：设计并合成针对miz1基因的sirna寡核苷酸，克隆入sirna表达载体,脂质体瞬时转染入hela细胞中,用rtpcr检测miz1基因的mrna表达水平,用 western blot检测miz1蛋白表达水平，用mtt法检测hela细胞活力. 结果：dna测序和酶切鉴定证明针对miz1基因的sirna表达载体构建成功，rtpcr和western blot表明其能降低miz1基因的mrna表达和蛋白表达. 与对照组相比，转染上述干扰载体后的hela细胞，在加入阿霉素12 h后,细胞活力明显降低（p<0.05），并且干扰质粒与阿霉素存在交互作用（p<0.05），以加入阿霉素12 h和24 h后最明显. 结论：针对miz1基因的sirna能够抑制人宫颈癌细胞系hela中miz1基因的表达并能增强hela细胞对阿霉素的敏感性.
【关键词】 转录因子miz1；rna干涉；转染；阿霉素
0引言
化疗是肿瘤 治疗 的常规手段，拓扑异构酶ⅱ抑制剂阿霉素作为常用的化疗药物之一，其能引起dna断裂，诱导细胞凋亡，并且这一作用与靶细胞内某些基因如cmyc的表达水平密切相关. miz1为myc相互作用的锌指蛋白，属于pozzf转录因子家族成员［1］. 目前 发现miz1能调节细胞的增殖和分化［2］，并与细胞凋亡密切相关［3］. 在辐射引起细胞dna损伤时，miz1的敲弱可使细胞从g1期阻滞走向凋亡［4］，当阿霉素引起dna损伤并诱导细胞凋亡时，miz1的表达异常可能会影响阿霉素对靶细胞的杀伤效果. 为探讨miz1的表达与肿瘤细胞对阿霉素敏感性的关系，我们采用rnai技术，构建了针对miz1的sirna的表达载体转染入人宫颈癌细胞系hela, 通过半定量rtpcr以及免疫印迹检测内源性miz1的表达并采用mtt法检测hela细胞的活力，为进一步 研究 miz1影响肿瘤细胞对阿霉素的敏感性机制提供依据.
1材料和方法
1.1材料psilencertm 3.1h1 neo载体（美国ambion公司）；rna反转录试剂(美国promega公司)；各种限制性内切酶，t4 dna连接酶和pcr试剂（美国gibco公司）；dna提取及回收试剂盒（上海华舜公司）；lipofectaminetm 2000（美国invitrogen公司）；odyssey红外荧光扫描成像系统（美国licor公司）；大肠杆菌dh5α菌种，人宫颈癌细胞系hela（第四军医大学生物化学与分子生物学教研室保存）；寡核苷酸片段（上海基康生物技术有限公司合成）；抗miz1抗体（美国santa cruz公司）；irdyetm 800红外荧光标记的羊抗兔二抗（美国rockland公司）.
1.2方法
1.2.1psilencertm 3.1h1 neomiz1基因载体的构建针对转录因子miz1基因的编码区选取19个核苷酸作为sirna作用靶点,设计并合成两条寡核苷酸片段，5′gatcccgccttacctgtgtgataagttcaa gagacttatcacacaggtaaggcttttttggaaa3′及5′agcttttccaaaaaagccttacctgtgtgataagtctcttgaacttatcacacaggtaaggcgg3′，其中gatcc为bamhⅰ酶切位点，agctt为hindⅲ酶切位点, gccttacctgtgtgataag为设计的sirna 序列，ttcaagaga转录后形成发夹环. 将上述两条寡核苷酸片段分别溶于双蒸水中至终浓度为50 pmol/l. 30 μl退火体系中加入：10×退火缓冲液3 μl，两种寡核苷酸片段各13.5 μl. 加热至95℃，于37℃恒温孵箱内放置2 h. 退火产物与线性化的psilencertm 3.1h1 neo载体连接，之后转化大肠杆菌dh5α，提取质粒，选取载体中的ecori酶切位点和克隆片断中的hindⅲ酶切位点进行双酶切，鉴定片段是否插入目的载体中，选取阳性克隆由上海生工生物工程技术公司进行测序，以确定其是否为目的片段. 同时设计非特异性序列：5′ttctccgaacgtgtcacgt3′，与人类基因无同源性，可以作为阴性对照.
1.2.2细胞转染将人宫颈癌细胞系hela以5×105/孔接种于6孔细胞培养板， 37℃，50 ml/l co2培养箱培养24 h，当细胞长至80%汇合时进行转染. 转染操作方法按照lipfectaminetm 2000说明书进行，转染48 h后收取细胞样品，用于rtpcr和蛋白印迹检测.
1.2.3rtpcr检测运用软件primer premier 5.0针对miz1基因的cdna设计引物，其上游引物为：5′gatgacatggtcacgctggctacc3′，下游引物为：5′gcatgtgcgaatccacacagccca3′，产物为248 bp的片段. 针对gapdh的cdna设计引物，其上游引物为：5′gcctcaagatcatcagcaat3′， 下游引物为：5′aggtccaccactgacacgtt3′，产物为307 bp的片段. 按trizol试剂盒操作说明提取转染所得细胞的总rna，紫外分光光度计测定总rna浓度，取1 μg总rna按照反转录试剂盒说明书进行反转录,并进行pcr扩增. pcr扩增反应总体积为50 μl：其中10×buffer 5 μl, 25 mmol／l mgcl2 3 μl，10 mmol／l dntp 1 μl，taq聚合酶1 μl，模板cdna 2 μl，用于扩增miz1基因cdna或gapdh基因cdna的引物各1 μl，余下体积用无菌去离子水补足. pcr反应的参数为：94℃预变性4 min，94℃ 1 min,55℃ l min，72℃ l.5 min，共25个循环：72℃延伸5 min. 扩增结束后取pcr产物5 μl，在10 g/l琼脂糖凝胶上电泳，观察并记录结果.
1.2.4免疫印迹检测转染后48 h收细胞并裂解细胞,取20 μg处理后的蛋白样品进行sdspage,电转移至nc膜，50 g/l脱脂奶粉封闭1 h，与1∶1000稀释后的一抗孵育1 h,tbst洗膜，然后与1∶20 000稀释后的红外荧光标记的二抗孵育1 h，tbst洗膜后, odyssey 红外荧光扫描成像系统 分析 .
1.2.5mtt法检测细胞增殖取对数生长期的hela细胞，于转染前1 d以5×104/孔接种于96孔板中，将重组质粒和对照质粒分别转染入细胞中，36 h后往其中一部分转染后的细胞中加入阿霉素至终浓度为2 mg/l，根据是否转染干扰质粒和是否加入阿霉素分成4组：转染干扰质粒+加阿霉素组；转染干扰质粒组和转染对照质粒+阿霉素组；转染对照质粒组. 每组设6个复孔. 继续培养0,6,12及24 h后分别加入5 g/l mtt 20 μl,37℃继续培养4 h,弃去培养基，加入150 μl dmso，酶标仪测定各孔a492 nm吸光度值.
统计学处理：采用spss 10.0统计软件进行统计分析，各时间点中各组吸光度值均以x±s表示，用析因分析对各时间内各组吸光度值进行统计分析， p<0.05为差异具有统计学意义.
2结果
2.1miz1基因干扰载体的构建psilencertm 3.1h1 neomiz1琼脂糖凝胶电泳图结果显示，用ecorⅰ和hindⅲ进行双酶切，在重组载体中能观察到 160 bp的特异性片段，而在非重组载体中并未观察到特异性片段的出现，说明设计的miz1 sirna寡核苷酸片段已成功插入载体中. 将该阳性克隆提取质粒，进行序列测定，测序结果表明插入片段与设计的寡核苷酸片段完全吻合（图1）.
2.2miz1基因干扰载体对hela细胞内miz1 mrna表达的抑制作用运用rtpcr的 方法 检测miz1的mrna的水平的结果显示，转染miz1基因干扰质粒组中miz1基因的mrna水平明显降低，而转染对照质粒组与未转染质粒组中miz1基因mrna的表达明显高于转染干扰质粒组（图2）.
2.3miz1基因干扰载体对hela细胞内miz1蛋白表达的抑制作用用免疫印迹检测miz1蛋白的表达结果显示，在瞬时转染的hela细胞中，内源性miz1蛋白的表达明显降低. 而对照质粒组与未转染质粒组中miz1蛋白的表达量明显高于转染干扰质粒组（图3）.
2.4hela细胞转染miz1干涉质粒后显著增强对阿霉素的敏感性运用mtt法检测hela细胞活力的结果显示，在加入阿霉素12 h后，不同组间细胞活力的差异具有统计学意义（p<0.05），转染miz1干扰质粒和加阿霉素组的hela细胞活力明显降低，转染miz1干扰质粒未加阿霉素组，细胞活力降低不明显，两者差异具有统计学意义（p<0.05）, 并且转染干扰质粒与阿霉素存在交互作用（p<0.05），以12 h和24 h最为明显，说明转染干扰质粒后，hela细胞对阿霉素的敏感性增强（图4）.
3讨论
rnai已 发展 成为一种高效的实验技术，被广泛用于新基因筛选、基因功能鉴定以及基因 治疗 等方面，具有非常广阔的 应用 前景［5］. 本实验中，我们采用的psilencertm 3.1h1 neo载体的启动子h1是rna聚合酶ⅲ启动子［6］，构建了miz1基因的sirna表达载体,该表达载体在人宫颈癌细胞系hela中能够有效降低内源性miz1的表达，说明我们构建的干扰载体可以成功的抑制hela细胞中miz1的表达，为我们 研究 miz1 影响 肿瘤细胞对阿霉素的敏感性机制奠定了基础. 同时在实验中我们还发现，转染干扰质粒后，miz1蛋白水平的降低要比其mrna水平的降低更加明显，这提示我们所设计的sirna不仅降低了miz1基因的mrna水平，同时也能抑制miz1基因的mrna的翻译.
肿瘤细胞对化疗药物的敏感性将会影响到化疗药物的治疗效果. 很多因素可以影响到肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，包括基因突变，基因扩增和表观遗传学的改变［7］. 某些基因的表达异常也会影响肿瘤细胞对化疗药物的敏感性［8］. 在本实验中，我们选择hela细胞，是因为hela细胞既为肿瘤细胞，同时又是工具细胞，转染效率高. 在实验中，我们发现，在加入阿霉素后，miz1的表达可有效抑制的hela细胞，其生长受到的抑制更明显,说明miz1被干扰降低后，hela细胞对阿霉素的敏感性增强,这提示miz1的表达异常与肿瘤细胞对化疗药物的敏感性密切相关. 这为深入理解miz1生物学功能提供了新方向，同时也为肿瘤的治疗提供了新的思路. 这一现象的具体机制有待进一步的研究阐明.
【 参考 文献 】
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