【关键词】
乙型肝炎病毒；宫内感染；人类白细胞抗原dr等位基因(hla-dr) 摘要： 目的 研究人类白细胞抗原(hla)-dr3、dr7、dr13、dr53等位基因与乙型肝炎病毒(hepatitis b virus，hbv)宫内感染的关系，探讨hbv宫内感染的遗传易感性，确定hbv宫内感染的易感基因和保护基因。方法 采用聚合酶链反应/序列特异性引物(pcr-ssp)技术检测hbsag阳性孕妇及其新生儿各187例外周静脉血血块中hla-dr3、dr7、drl3、dr53等位基因型分布及频率。结果 (1)宫内感染组孕妇hla-dr3基因频率为2414％(7／29)，显著高于非宫内感染组孕妇的633％(10／158)(p=0007)。其余各表型比较，差异无统计学意义(p>005)。(2)宫内感染组新生儿hla-dr3基因频率为1724％(5／29)，显著高于非宫内感染组新生儿的506％(8／158)(p=0033)。其余各表型比较，差异无统计学意义(p>005)。(3)母婴hla-dr3同阳性在宫内感染组与宫内未感染组间比较差异有统计学意义(p=0049)；母婴hla-dr7、dr13、dr53同阳性在宫内感染组与宫内未感染组间比较，差异无统计学意义(p>005)。wWw.11665.COM结论 hbsag阳性孕妇及其胎儿同时或任一携带hla-dr3，易导致hbv宫内感染；hla-dr3是hbv宫内感染的易感基因。
关键词： 乙型肝炎病毒；宫内感染；人类白细胞抗原dr等位基因(hla-dr)
association between hla-dr alleles and hbv intrauterine infection
feng yongliang,wang suping,shi xiaohong,et al.
department of epidemiology,shanxi medical university (taiyuan 030001，china)
abstract： objective to study the association between hla-dr3,dr7,dr13,dr53 and hbv intrauterine infection to probe into the susceptibility to intrauterine infection of hepatitis b virus and to find its predisposing genes and protecting genes.methods hla-dr3,dr7,dr13,dr53 were detected by the technique of polymerase chain reaction-sequence specific primers(pcr-ssp) in maternal and neonatal blood clot.results (1) the frequency of hla-dr was 24.14% in women with intrauterine infection,which was higher than that (6.33%) in women without intrauterine infection(p=0.007).there was no association between hla-dr7,dr13,dr53 positive in pregnant women and hbv intrauterine infection(p>0.05).(2) the frequeney of hla-r of newborns was 17.24% in women with intrauterine infection,which is higher that (5.06%) in women withotll infection(p=0.033).there was no association between hla-dr7,dr13,dr53 positive in newborns and hbv intrauterine infection(p>0.05).(3)there was significant association between hla-dr3 concordance and hbvintrauterine infection(p=0.049).there was no association between dr7,dr13,dr53 concordance and hbv intrauterine infection(p>0.05).conclusion hla-dr3 carriers of pregnant women and their newborns have susceptibility to hbv intrauterine infection.hla-dr3 is the predisposing gene of hbv intrauterine infection.
key words： hbv；intrauterine infection；hla-dr antigen
肝炎是一种严重危害人类健康的世界性传染病，我国是乙肝高发区，乙肝病毒的母婴传播不仅造成人群中众多的hbsag携带者，而且是引起成人慢性肝炎、肝硬化以及肝癌的重要因素。迄今，多数学者认为，人类白细胞抗原dr等位基因(hla-dr)与乙型肝炎病毒(hbv)感染密切相关，而hla-dr等位基因与hbv宫内感染的关系争议较多。本文通过研究hla-dr3、dr7、dr13、dr53与hbv宫内感染的关系，探讨hbv宫内感染的遗传易感性，为防制hbv宫内感染提供理论依据。
1 对象与方法
11 对象 以2003年6月～2004年11月太原市省各市级医院筛检，并在太原市传染病院妇产科进行产前检查及分娩的hbsag阳性孕妇及其新生儿各187例作为研究对象。并根据新生儿有无宫内感染，分为宫内感染组(29例)和宫内未感染组(158例)，2组在年龄分布、文化程度、职业构成等均衡可比。
12 方法
121 标本采集及处理 收集孕妇肘静脉血及新生儿出生24h内且未注射高效价免疫球蛋白(hbig，hepatitis b immune globulin)的股静脉血各2ml，4℃冰箱保存，6h内以4000r/min4℃离心15min，分离血清与血块，-20℃保存备检。
122 乙肝血清标志物检测 采用酶联免疫吸附(elisa)法，试剂盒（上海科华实业总公司）。
123 hbv dna检测 (1)hbv dna提取：参考文献〔1〕，采用异硫氰酸胍一步法提取血清dna；(2)hbv dna的扩增：采用巢式聚合酶链反应(npcr)。
124 hla-dr等位基因检测 (1)人类基因组dna的提取十二烷基磺酸钠（sds）蛋自酶k法提取血块基因组dna。(2)hla-dr等位基因扩增：参考文献〔2〕的引物设计采用聚合酶链反应／序列特异性引物(pcr-ssp)技术检测孕妇及其新生儿外周静脉血血块中hla-dr3、dr7、dr13、r53基因型分布及频率。(3)pcr产物的检测：取扩增产物5～10μl，按5：1(v：v)与溴酚兰混匀，加样于15％琼脂糖凝胶(含05μg／ml溴化乙锭)板，在60v／cm电压下泳动50min，紫外灯下观察结果。
125 新生儿hbv宫内感染诊断标准 新生儿外周血血清hbsag和/或h
bv dna阳性，即诊断为hbv宫内感染。
13 统计分析
资料输入spss115软件进行统计分析；计算各指标的阳性率，四格表χ2、fisher确切概率、or值及or95%ci。
2 结果
21 hbsag阳性孕妇及其新生儿hla-dr扩增图谱 提取的血块dna经pcr扩增后呈现明显条带，与标准分子标记物（marker）条带比较，确定hla-dr基因型（图1，2，3，4）。
dr3+：hbsag阳性孕妇或其新生儿dr3阳性扩增产物，扩增产物片断长度为151bp;dr3-：hbsag阳性孕妇或其新生儿dr3阴性扩增产物；m：标准分子标记物(marker)
图1 hla-dr3等位基因的pcr扩增产物电泳结果（略）
dr7+：hbsag阳性孕妇或其新生儿dr7阳性扩增产物，扩增产物片断长度为232bp；drt-：hbsag阳性孕妇或其新生儿dr7阴性扩增产物；m：标准分子标记物(marker)
图2 hla-dr7等位基因的pcr扩增产物电泳结果（略）
dr13+：hbsag阳性孕妇或其新生儿dr13阳性扩增产物，扩增产物片断长度为130bp；dr13-：hbsag阳性孕妇或其新生儿dr13阴性扩增产物；m：标准分子标记物(marker)
图3 hla-dr13等位基因的pcr扩增产物电泳结果（略）
dr53+：hbsag阳性孕妇或其新生儿dr53阳性扩增产物，扩增产物片断长度为213bp；dr53-：hbsag阳性孕妇或其新生儿dr53阴性扩增产物；c：内对照
注：dr53引物与内对照引物可能发生了引物间的错配等，故分管同时扩增
图4 hla-dr53等位基因的pcr扩增产物电泳结果（略）
22 hla-dr与hbv宫内感染的关系
221 孕妇hla-dr等位基因分布及频率比较（表1） 宫内感染组孕妇hla-dr3基因频率明显高于宫内未感染组，经检验，差异有统计学意义（or=4709,p=0007）；hla-dr7、dr13、dr53基因频率在宫内感染组与宫内未感染组孕妇比较，经检验，差异无统计学意义（p>005）。
表1 宫内感染组与宫内未感染组孕妇hla-dr基因分布及频率比较（略）
注：*为fisher确切概率法计算结果
222 新生儿hla-dr等位基因分布及频率比较(表2) 宫内感染组新生儿hla-dr3基因频率明显高于宫内未感染组，经检验，差异有统计学意义(or=3906，p=0033)；hla-dr7、dr13、dr53基因频率在宫内感染组与宫内未感染组新生儿比较，经检验，差异无统计学意义(p>005)。
223 母婴hla-dr等位基因同阳性分布及频率比较（表3） 母婴hla-dr3同阳性在宫内感染组与宫内未感染组间比较，经检验，差异有统计学意义（or=596,p=0049），母婴hla-dr7、dr13、dr53同阳性在宫内感染组与宫内未感染组间比较，经验验，差异无统计学意义（p>005）。
表2 宫内感染组与宫内未感染组新生儿hla-dr基因分布及频率比较（略）
注：*为fisher确切概率法计算结果
表3 宫内感染组与宫内未感染组母婴hla-dr同阳性分布及频率比较（略）
注：*为fisher确切概率法计算结果
3 讨论
kilpatrickdc〔3〕的研究发现，hla-a3是人类免疫缺陷病毒(hiv)宫内感染的保护基因，hla-dr3是hiv宫内感染的易感基因。bosi l等〔4〕采用logistic回归分析发现，hla-dr13与发生hcv宫内感染呈负相关，即hla-dr13是hcv宫内感染的保护因素。在母亲同时感染hiv者中，hla-dr13和hiv同时感染在hcv宫内感染的发生中具有独立而相反的作用，即hla-dr13是hcv宫内感染的保护因素；hla-dr13表达在未发生hcv，宫内感染和发生了hcv宫内感染者的or值为84(95％ci=11～608)，且母乳喂养不影响该hcv宫内感染的危险度。王素萍等〔5〕以hbsag阳性孕妇新生儿为研究对象，随机选择发生及未发生hbv宫内感染的新生儿各20例，应用试剂盒提供的序列特异性引物(sequence specific primers,ssp)采用pcr-ssp技术扩增hla-dr基因区18对等位基因，判定hla-dr抗原的型别，计算hla-dr抗原各型别出现频率并分析其在2组间的差别，发现dr3、dr51在宫内感染组的频率较高，分别为45％，40％。在非宫内感染组分别为20％，15％，p值分别为018，016。dr53在非宫内感染组的频率较高，为60％，在宫内感染组为35％。推测hla-dr3、dr51可能是hbv宫内感染的易感型，而dr53有可能是具有保护作用型别。刘海英等〔6〕采用pcr-ssp法合成相应的特异性引物序列，对hla-dr3、dr4、dr13、dr15进行研究。结果显示，宫内感染组孕妇hla-dr3的基因频率为50％，显著高于宫内未感染组的147％(rr=58，χ2=490,p<005)，其余各基因表型比较，差异无统计学意义；宫内感染组新生儿hla-dr3的基因频率为30％，明显高于宫内未感染组的74％，但差异无统计学意义(p>005)，提示孕妇或胎儿携带hla-dr3，易导致hbv宫内感染，即孕妇或胎儿hla-dr3阳性是hbv宫内感染的易感基因。本文同样采用pcr-ssp技术研究hla-dr特异性等位基因与hbv宫内感染的关系。结果表明，hbsag阳性孕妇及其胎儿同时或任一携带hla-dr3，易导致hbv宫内感染；hla-dr3是hbv宫内感染的易感基因。提示在防制hbv宫内感染时不能忽视人类遗传因素的作用，应采取综合措施防制hbv宫内感染。
参考文献
〔1〕 向海平，郭雁宾，孟庆华，等.聚合酶链反应定量检测乙型肝炎病毒dna及其临床意义分析［j］.中华实验和临床病毒学杂志，1999，13（1）：89-90.
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〔3〕 kilpatrick dc,hague ra,yap pl,et al.hla antigen frequencies in children born to hiv-infected mothers［j］.dis markers,1991,9(1):21-26.
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〔5〕 王素萍，孔宪毅，薛淑莲，等.hla-dr抗原与hbv宫内感染关系研究［j］.
