【摘要】 目的 探索间充质干细胞(mscs)在人胎盘组织中的分布规律。方法 取正常剖宫产之足月健康产妇的新鲜胎盘组织,按中央带、中间带、边缘带、绒毛板层、中间层和基底板层分为9组:aa、ab、ac、ba、bb、bc、ca、cb、cc。连续切片,以抗cd166、抗cd44、抗cd29分别做免疫荧光和免疫组化染色。显微镜下观察阳性细胞分布区域,采用hpias1000彩色病理图像分析系统进行图像分析。结果 cd166、cd44、cd29阳性表达细胞的分布情况较一致,主要集中于血管内皮下及血管附近间质内。胎盘中央带中间层(ab)阳性细胞较集中,阳性表达的强度较强,其od值与其它组差异有统计学意义(p<0.05)。边缘带阳性细胞稀少,阳性表达的强度较弱。结论 胎盘各部位均存在cd166、cd44、cd29阳性表达的细胞,但脐带附着处下方胎盘中间层相对其他部位可能为mscs富集区域。
【关键词】 间充质干细胞 胎盘 染色
an experimental study
miao zongning, xu qiulan, pan yuhong, wang ling, zhu jianzhong
(cell research laboratory, wuxi third people′s hospital, wuxi 214041, jiangsu, china)
to investigate the distribution pattern of mesenchymal stem cells (mscs) in human placentas by immunofluorescence staining and immunohistochemical staining. methods fresh normal term placental tissues were taken from cesarean section without medical indication, and based on the central zone(a), the intermediate zone(b), the marginal zone(c), the chorionic plate layer(a), the middle layer(b) and the basal layer(c), they were divided into 9 groups: the aa, ab, ac, ba, bb, bc, ca, cb and cc groups. then, serial section, immunofluorescence staining and immunohistochemical staining were used to study the expressions of cd166, d44 and cd29. the hpias1000 colored image analysis system was used to analyze distribution of positive expression cells. results cd166, cd44 and cd29 positive cells were mainly concentrated in the area under vascular endothelial cells and in the stroma surrounding the vessel. there were many strongly positive cells in the intermediate zone and the middle layer of the placenta (ab) and few positive cells in the marginal zone(c). conclusion cd166, cd44 and cd29 positive cells could be found in every position in human placentas, but were mainly distributed in the intermediate zone and the middle layer of the placenta (ab).
key words: mesenchymal stem cells; placenta; location; staining
胎盘作为间充质干细胞的新来源备受关注。WWW.11665.COm目前国内外对胎盘来源间充质干细胞(placenta derived mesenchymal stem cells, pmscs)免疫调节、定向分化的相关研究较多,但缺乏公认的精确的分离和纯化pmscs的方法。本实验取不同部位的胎盘组织,分别作cd166、cd29、cd44免疫荧光染色,观察比较3个标记物的阳性表达情况,旨在了解人胎盘组织中mscs的分布规律。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂和仪器 冰冻切片机购自leica公司,荧光显微镜bx51和数码成像系统dp50购自olympus公司,图像分析系统hpias1000购自新华海公司,鼠抗人单克隆抗体cd44购自exalpla biological inc公司,鼠抗人单克隆抗体cd29购自ancell公司,鼠抗人单克隆抗体cd166、羊抗鼠荧光抗体购自bioscience公司,sabc试剂盒、dab显色试剂盒购自迈新公司。
1.1.2 胎盘组织 在产妇知情同意的情况下,经医院伦理委员会批准,获取临床正常剖宫产之足月健康产妇的新鲜胎盘组织,所选择的胎盘脐带附着点均在胎盘中央或稍偏位,大小及重量在正常范围内。
1.2 方法
1.2.1 分组 将胎盘组织分为中央带即脐带附着处(a)、边缘带即距脐带附着点最远处(c)和中间带即两者之间中点处(b)3大组,每组从胎儿面向母体面再分为绒毛板层(a)、中间层(b)和底板层(c)3小组。
1.2.2 冰冻切片 取aa、ab、ac、ba、bb、bc、ca、cb、cc 9处新鲜组织,大小为1cm×1cm×0.3cm,以oct包埋于冻台上,速冻后切5μm薄片,贴附于载玻片。
1.2.3 石蜡切片 取前述9处组织,大小为1cm×1cm×0.3cm,中性福尔马林液中固定24h,梯度酒精溶液脱水,二甲苯透明,浸蜡,石蜡包埋后切5μm薄片,贴附于涂布多聚赖氨酸的玻片。
1.2.4 染色
1.2.4.1 免疫组化染色(sabc法) 切片置60℃烘箱内过夜,取出后以二甲苯脱蜡,梯度酒精洗去二甲苯、水化,pbs冲洗3min×3次,置枸橼酸钠溶液中微波加热以修复抗原,自然冷却后以pbs冲洗3min×3次,滴加抗体(cd29、cd44,阴性对照滴加pbs),室温1h,pbs冲洗3min×3次,滴加免疫反应增效剂,dab显色3～10min,充分水洗,苏木素复染5s,盐酸酒精分化1s,流水促蓝,梯度酒精脱水,二甲苯透明后以中性树胶封片,置显微镜下观察。
1.2.4.2 免疫荧光染色 将冰冻切片稍稍风干后即滴加ι抗(cd166,浓度为1∶400,阴性对照滴加pbs),置37℃水浴箱中1h,pbs冲洗3min×3次,洗去多余抗体,滴加fitc标记的荧光抗体(浓度为1∶100),置37℃水浴箱中30min,pbs冲洗3min×3次,置荧光显微镜下观察。
1.3 统计学处理 采用spss 10.0统计学软件进行统计学分析。计量资料以
2 结 果
2.1 免疫荧光染色和免疫组化染色结果 见图1～3。由图1可见,cd166阳性细胞主要分布于各组血管内皮下、血管附近间质内以及绒毛板层间质内；胎盘中间带中间层血管内皮下细胞表达呈强阳性,显著强于其他区域，绒毛板层间质内散在较强阳性细胞,血管内皮下阳性细胞分布亦较密集，胎盘边缘带各层阳性反应不甚明显。由图2可见,cd29阳性细胞主要分布于血管内皮下及血管附近间质内；绒毛板层间质内散在阳性细胞，胎盘中间带中间层血管内皮下细胞表达呈强阳性，绒毛板层间质内散在较强阳性细胞,部分羊膜上皮和部分绒毛膜上皮亦呈阳性反应。由图3可见,cd44的阳性表达范围与cd29无明显差别,cd44阳性细胞亦主要分布于血管内皮下及血管附近间质内；绒毛板层间质内散在阳性细胞，胎盘中间带中间层血管内皮下细胞表达呈强阳性，绒毛板层间质内散在较强阳性细胞,血管内皮下阳性细胞分布亦较密集。表1 胎盘不同组织层间cd166、cd29、cd44表达阳性细胞平均光密度值比较
3 讨 论
目前关于mscs相对成熟的研究主要集中于骨髓。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,bmscs)在体外分离培养方法简单、增殖速度快,但是骨髓中mscs含量极低,约占有核细胞数的0. 001％～0. 01％,并且bmscs的数量和分化能力随着年龄的增长而减少和减弱［12］。与骨髓相比,胎盘来源丰富,取材对供者无任何伤害。在产妇知情同意的基础上,采集、保存pmscs容易,不存在伦理道德方面的问题,可以视为极具潜力的干细胞新来源［3］。cd44(纤维蛋白和透明质酸盐受体)、cd29(β整合素)和cd166(白细胞活化黏附因子)分属黏附分子的不同亚类,是鉴定mscs的常用标记物［4］,联用此3种分子的抗体识别胎盘组织的mscs,可提高检出率和实验的可靠性。本实验结果表明,胎盘9个部位的组织中均存在cd44、cd29、cd166阳性的细胞,提示mscs广泛存在于整个胎盘组织内,是胎盘作为干细胞充裕来源的又一佐证。
胎盘作为母体和胎儿之间进行物质交换的重要场所,是个血管丰富的器官。从胎儿面至母体面各层结构不尽相同,血管密度亦不一致。血管周围细胞cd29、cd44、cd166阳性表达较明显,提示mscs的分布与血管的分布关系密切。he切片中可见大量毛细血管集中在胎盘中间层(b),而免疫标记物染色亦显示中间层(b)的阳性细胞数量与表达水平强于绒毛板层(a)和底板层(c);同为中间层(b),中央带(a)较中间带(b)及边缘带(c)表达更强。可以推测,在接近脐带附着部(血管丰富)的胎盘中间层(ab)取材易于获得较丰富的pmscs。
本研究结果显示,表达cd44、cd29、cd166的细胞广泛分布于胎盘不同部位的血管周围、间质细胞、羊膜细胞以及部分绒毛膜上皮细胞,由阳性细胞与血管的关系可以认为pmscs中的一部分是血管来源的mscs。目前对于血管来源的mscs研究并不多,大多数血管是从一个内皮管开始发育的,然后经血管平滑肌细胞包裹而成,而血管平滑肌细胞是从一个未分化的血管周围间充质干细胞发育而来的［5］。血管周围间充质干细胞具有骨髓来源的间充质干细胞的许多特性,诸如α平滑肌肌动蛋白、血小板源生长因子受体介导的生长刺激和通过典型的平滑肌通路的分化潜能［6］。有关脐带间充质干细胞的研究也表明间充质干细胞样细胞存在于脐静脉内皮／内皮下层［7］。此外,羊膜细胞以及部分绒毛膜上皮细胞亦表达部分mscs的标志物。这些都提示pmscs可能是一个不同来源的mscs的集合,尽管这些不同来源的mscs在生物学行为上是否一致仍有待于进一步研究,但胎盘可以作为临床和基础研究中mscs的一种有效来源。
【参考文献】
［1］ silva w a jr, covas d t, panepucci r a, et al. the profile of gene expression of human marrow mesenchymal stem cells［j］. stem cells, 2003, 21(6):661669.
［5］ hellstr[ako¨d〗m m, kalén m, lindahl p, et al. role of pdgfb and pdgfrbeta in recruitment of vascular smooth muscle cells and pericytes during embryonic blood vessel formation in the mouse［j］. development, 1999, 126(14):30473055.
［6］ 刘晓丹，刘兵,李秀森，等.人脐带静脉灌注液间充质干细胞的分离和鉴定［j］.中国实验血液学杂志， 2007, 15(5):10191022.
［7］ hong s h, gang e j, jeong j a, et al. in vitro differentiation of human umbilical cord bloodderived mesenchymal stem cells into hepatocytelike cells［j］. biochem biophys res commun, 2005, 330(4):11531161.
