摘要】 目的: 检测ptpn22基因的单核苷酸多态性（snp）及其与中国人自身免疫甲状腺病（aitd）的相关性, 并研究ctla4基因snp与ptpn22 snp的相互关系。方法: 采用pcrrflp技术分析231例aitd患者, 其中graves’病（gd）149例, 桥本甲状腺炎（ht）82例和131例健康对照者ptpn22基因+1858 c>t及ctla4基因49a>g位点的基因型。采用sasppcr技术分析ptpn22基因启动子-1123g>c的基因型。结果: （1）ptpn22基因的+1858c>t位点不存在多态性; （2）ptpn22基因-1123g>c snp的等位基因和基因型分布频率在gd组与正常对照组间的差异有统计学意义（p值分别为0.040和0.013, or值分别为1.44和2.33）; （3） ctla4基因 49a>g位点的等位基因和基因型分布频率在aitd组与正常组间有明显差异; （4）与携带ptpn22的g等位基因及ctla4的aa基因型者相比, 携带ptpn22cc基因型与ctla4 ag或gg基因型者发生gd的or值=3.31（95%ci: 2.69-8.89）。结论: ptpn22基因启动子-1123g>c snp与gd的发生相关, 其cc基因型与ctla4基因的g 等位基因对gd的发生起协同作用。
【关键词】 蛋白酪氨酸磷酸酶非受体型22基因 自身免疫性甲状腺病 单核苷酸多态性
自身免疫性甲状腺病（autoimmune thyroid disease, aitd）是一组以甲状腺为靶器官的自身免疫性疾病, 包括graves病（graves’ disease, gd）、桥本甲状腺炎（hashimoto’s thyroiditis, ht）及产后甲状腺炎等。WWW.11665.cOm遗传因素在aitd的发病中起重要作用, 目前比较肯定的aitd易感基因有人类白细胞抗原基因（human leucocyte antigen, hla）和细胞毒性t淋巴细胞相关抗原4（cytoxic t lymphocytoassociated antigen4, ctla4）基因。蛋白酪氨酸磷酸酶非受体型22(ptpn22)基因编码淋巴特异性酪氨酸磷酸酶（lyp）, lyp是一种细胞内的酪氨酸磷酸酶, 通过其富含脯氨酸的基序（称为p1）与csk激酶（c末端src酪氨酸激酶）的sh3结构域相结合, 二者的作用使与t细胞受体（tcr）信号转导有关的激酶如lck、 fyn和zap70去磷酸化, 发挥抑制t细胞活化的作用［1］。多个大型、 独立的研究重复了ptpn22基因620密码子的1858c/t snp与1型糖尿病(t1d)［2］、 类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis, ra）［3］、 aitd［4］、 系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus, sle）［5］等有相关性, 然而对日本人群ra［6］、 t1d［7］以及gd［8］的大样本相关性分析并未发现ptpn22的1858t snp。为此, 我们选择了与高加索人aitd的发生有相关性的外显子14+1858 snp以及与日本人t1d的发生相关的启动子-1123 snp为研究内容, 观察中国北方汉族人群上述位点是否存在多态性以及与aitd的相关性, 并分析ctla4基因多态性与ptpn22的关系, 探讨aitd的遗传背景。
1 材料和方法
1.1 材料 病例组为在西安交通大学第一附属医院内分泌专科门诊收集的231例aitd患者, 平均年龄（36.7±14.2）岁, 其中gd 149（男40, 女109）例; ht 82（男21, 女61）例。gd和ht的诊断依据为典型的临床表现结合实验室检查。从我院查体中心按aitd患者的年龄分布、 性别构成随机选取131例健康人为对照, 其中男39例, 女92例, 年龄（34.5±13.3）岁。离心柱型血液/细胞/组织基因组dna提取试剂盒与pcr扩增试剂盒2 taq pcr masterix均购自北京天为时代公司; 限制性内切酶rsa i购自纽英伦生物技术有限公司; bbv i购自宝生生物工程有限公司。引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成。
1.2 方法
1.2.1 外周血基因组dna的提取 清晨空腹静脉血edta抗凝, 采用离心柱型血液/细胞/组织基因组dna提取试剂盒提取外周血基因组dna, 按说明书操作。
1.2.2 pcr扩增反应 （1）pcr扩增ptpn22基因外显子14: 根据genbank中的ptpn22基因序列自行设计引物, 上游引物为: 5′tgg gct caa gtg atc ctc tca3′, 下游引物为: 5′act gat aat gtt gct tca acg ga3′。反应体系20 μl, 其中2×taq pcr masterix 10 μl, 基因组dna 1 μl, 上下游引物（10 μmol/l）各1 μl。经94℃预变性3 min, 94℃变性30 s, 56℃退火30 s, 72℃延伸30 s, 循环30次后72℃延伸5 min, 150 g/l琼脂糖凝胶电泳鉴定pcr产物。（2） pcr扩增ptpn22启动子: 设计1条共用的上游引物和2条针对3′ 特异性等位基因的下游引物: 上游引物为: 5′acc ctg cat atg taa tgc tgg t3′, 下游引物1: 5′cat tga gag gtt atg caa gct c3′, 下游引物2: 5′cat tga gag gtt atg caa gct g3′。用2对引物分别扩增同一标本, 扩增片段长度均为268 bp。反应体系均为20 μl, 其中2×taq pcr masterix 10 μl, 基因组dna 1 μl, 上下游引物（10 μmol/l）各1 μl。引物1退火温度为60℃ 30 s, 引物2退火为62℃ 30 s, 余pcr循环条件同上, 200 g/l的琼脂糖凝胶分析pcr产物。（3）pcr扩增ctla4的外显子1: 根据文献报道合成引物, 上游引物: 5′gaa gga tgg tgc ttc aca gat3′, 下游引物: 5′ctt tgc aga aga cag gga tga3′ ［9］。pcr反应体系为20 μl: 含2×taq pcr masterix 10 ml, 上下游引物各1 μl, 基因组dna 1 μl。退火温度54℃ 30 s, 余pcr循环条件同上, 150 g/l琼脂糖凝胶分析pcr产物。
1.2.3 酶切反应 酶切反应体系均为20 μl, pcr扩增产物均为9 μl, 分别用rsa i (10 u/μl) 0.5 μl酶切ptpn22外显子14, 37℃水浴过夜; bbv i（3 u/μl） 0.5 μl酶切ctla4外显子1, 65℃水浴过夜。酶切产物于250 g/l琼脂糖凝胶检测。
1.3 统计学处理 读取个体样本, 计算各组基因型频率, 确认其符合hardyweinberg平衡, 用基因计数法计算各组等位基因频率。采用spss11.5软件行统计学处理, 对组间计数资料采用行列表χ2检验, 对不符合四格表χ2检验的数据进行fisher确切概率法分析。or值(odds ratio, 比值比)用woolf 法。
2 结果
2.1 ptpn22基因和ctla4基因的pcrrflp分析 ptpn22外显子14 pcr扩增片段长度为506 bp, 经rsa i酶切可得到3种结果: +1858 snp为cc基因型时酶切产物为300 bp和206 bp2个片段; tt基因型为506 bp1个片段; ct基因型产生506 bp、 300 bp和206 bp3个片段（图1）。
图1 ptpn22基因外显子14酶切产物的琼脂糖凝胶电泳（略）
fig 1 the agarose gel electrohhoresis analysis of digested product in ptpn22 gene exon 14
m: dna marker; 1, 2, 4, 5: cc genetype; 3: ct genetype.
ctla4外显子1的pcr扩增片段长度为652 bp, 经bbv i酶切可得到3种结果: 49a/g snp为基因型aa时产生556 bp和96 bp2个片段; 基因型gg产生480 bp、 76 bp和69 bp3个片段; 基因型ag产生556 bp、 480 bp、 96 bp和76 bp4个片段。由于96 bp及76 bp相对分子质量（mr）小, 电泳只显示556 bp及480 bp（图2）。
图2 ctila4外显子1酶切产物的琼脂糖凝胶电泳（略）
fig 2 the agarose gel electrohhoresis analysis of digested product in ctila4 gene exon 1
m: dna marker; 1-3: ag genetype; 4: control; 5, 6: gg genetype.
2.2 ptpn22基因的sasppcr分析 ptpn22启动子扩增片段的长度为268 bp, 下游引物1针对等位基因g, 下游引物2 针对等位基因c。-1123snp为gg基因型时下游引物1可扩增出pcr产物; cc基因型时下游引物2可扩增出pcr产物; gc基因型时2对引物均可扩增出pcr产物（图3）。
图3 ptpn22基因启动子扩增产物的琼脂糖凝胶电泳（略）
fig 3 the agarose gel electrohhoresis analysis of pcr product in ctila4 gene promoter
m: dna marker; a: primer 1; b: primer 2; 1, 5: gc genetype; 2, 3: gg genetype; 4: cc genetype.
2.3 各组间各位点的等位基因及基因型分布频率比较 ptpn22基因外显子14+1858c>t位点t等位基因的频率<1%, 说明该基因座在中国北方汉族人群不具有多态性。ptpn22基因启动子-1123g>c snp在各组内男性和女性之间的等位基因及基因型频率分布无明显差异, c等位基因的分布及cc基因型频率在gd组与正常对照组之间有明显差异而在aitd组、 ht组与正常对照组之间的分布无明显不同（表1）。ctla4外显子1 49a>g 位点的g等位基因在aitd组、 gd组、 ht组均明显高于正常对照组, 差异有统计学意义; 各病例组与正常对照组基因型分布频率也有显著性差异（表2）。
表1 ptpn22基因启动子-1123g>c的等位基因与基因型分布频率（略）
tab 1 genotypes and alleles frequency of the-1123g>c snp in ptpn22 gene promoter region
ap<0.05 vs normal group.
表2 ctla4基因外显子1 49a>g的等位基因与基因型分布频率（略）
tab 2 genotypes and alleles frequency of the 49 a>g snp in ctla4 gene exon 1
ap<0.05 vs normal group; bp<0.01 vs normal group.
2.4 ptpn22和ctla4基因的相互作用与gd的易感性 ptpn22的cc基因型与ctla4的ag或gg基因型在增加aitd的易感性方面有协同作用, 与携带ptpn22的g等位基因及ctla4的aa基因型者相比,携带ptpn22的cc基因型与ctla4的ag或gg基因型者发生gd的or值=3.31（表3）。
表3 ptpn22基因型和ctla4基因型相互作用与gd的关系（略）
tab 3 effect of ptpn22 and ctla4 genotype on gd
3 讨论
目前对ptpn22基因与疾病相关snp的研究主要针对位点+1858 c>t, 这个位于p1结构域的snp由编码色氨酸（trp）的tgg密码子替代了编码精氨酸(arg)的密码子cgg, 结构上的变异导致了功能缺陷, 免疫沉淀法证实arg 620可与csk的sh3结构域结合, 而trp 620却不能与后者结合, 由此推断trp 620降低了lyp下调t细胞活化的作用。在以后的研究中还发现了一种剂量效应关系, 即纯合子个体（1858tt）的lyp与csk的结合能力比杂合子个体(1858ct)更低。由此可见ptpn22似乎为tcr信号的转导设置了一个阈值, 当ptpn22与csk的结合有缺陷时, 对tcr信号转导的抑制作用减弱, t细胞活化的阈值降低, 免疫系统的活性全面增强, 触发了许多潜在的自身免疫反应。但我们的研究未发现+1858t snp, 这与高加索及北欧等人群中普遍存在此snp位点且与多种自身免疫病相关的结论不同, 却与先前日本人群的研究结果相似, 说明该基因在亚洲人群中缺少+1858c/t snp。我们进一步分析了ptpn22启动子-1123g>c位点, 结果提示此位点的snp与gd的发生相关, 说明除+1858c>t 外, ptpn22基因上存在与aitd相关的其他snps。文献报道在高加索人, -1123g>c与+1858c>t两多态性位点之间存在连锁不平衡（d’=0.99, r2=0.57, χ2=378.8, p=8.5×10-82）, 由此作者推断-1123g>c与自身免疫病的相关性可能是通过与+1858c>t连锁不平衡而发挥作用的［7］。我们的研究中未发现这种连锁不平衡, 至于-1123g>c snp, 目前还不十分明确其对lyp表达的影响。有人研究此位点周围的dna序列, 发现-1123g与转录因子激活蛋白4(ap4)的结合位点相匹配, 后者属螺旋环螺旋拉链结构家族, 结合转录因子反义链。-1123g>c位于ap4结合序列的中心基序区域(-1130gcaagctgaa-1121)［10］, 而-1123c等位基因不能与任何已知的转录因子的结合元素相匹配。因此, ptpn22的-1123c可能影响了lyp的转录效率, 我们推测这可能是-1123g>c多态性与gd呈相关性的原因。
aitd是一种多基因遗传性疾病, 基因之间的相互作用可能影响疾病的发生。我们的研究提示ctla4基因是aitd的易感基因, 其与ptpn22基因snp的分布之间无关联, 但两基因均为突变型时增加了gd发生的机会。即说明两基因的变异对疾病的发生起协同作用, 虽然我们的研究不能对这一协同作用的病理生理基础做出解释。
总之, +1858c>t snp具有种族特异性, 它并不是ptpn22基因上与aitd相关的惟一位点, 我们的研究初步证实该基因启动子的-1123g>c snp与中国北方汉族人群gd的发生有相关性, ptpn22基因上是否有其他未知的变异或单倍体与aitd相关, 有待于更深入的研究。
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