慢性hcv感染患者pbmc体外th1类细胞因子分泌及其相关因素分析
【摘要】 目的：研究慢性hcv（丙型肝炎病毒）感染患者外周血单个核细胞（pbmc）体外th1类细胞因子的分泌，进一步了解hcv感染慢性化和肝损伤机制. 方法：体外培养慢性hcv感染患者pbmc 72 h后，elisa检测培养上清th1类细胞因子(il2，ifnγ，tnfα)，荧光定量pcr检测患者血清hcv rna含量，rtpcr检测hcv rna亚型. 结果：与正常人相比，ifnγ在hcv rna阴性患者中明显增高，而在rna阳性患者中无明显升高. tnfα则不论rna滴度的高低均较正常人显著增高. rna阳性患者alt（丙氨酸氨基转移酶），ast（门冬氨酸氨基转移酶）水平明显高于阴性患者. 不同hcv基因型感染的患者ifnγ，tnfα的分泌无显著差异. 结论：ifnγ在清除病毒中起重要作用，tnfα是引起肝脏损伤的重要因素之一.
【关键词】 c型肝炎样病毒属
0引言
hcv（丙型肝炎病毒）感染后易于慢性化，但其慢性化机制仍不十分清楚. 有研究［1-2］表明，天然免疫、体液免疫以及细胞免疫均对病毒的清除有重要作用，而细胞免疫尤为重要. th1类细胞因子是参与细胞免疫的重要物质，在细胞清除细胞内病原体的免疫应答过程中起关键作用，但同时也是诱发肝脏损伤的重要机制. 我们比较了hcv感染后体内不同病毒滴度及不同的基因型患者的外周血单个核细胞（pbmc）体外分泌th1类细胞因子及肝脏的炎症情况，以进一步了解hcv感染慢性化和肝损伤机制.
1对象和方法
1.1对象收集我院2005年门诊或住院的慢性hcv感染患者44（男35，女9）例， 平均年龄42.3（15～67）岁，所有病例均符合2000年西安全国第十次病毒性肝炎及肝病学术会议修订的《病毒性肝炎防治方案》慢性hcv感染诊断标准［3］. 对照10例为健康献血员. 淋巴细胞提取液、trizol、细胞因子elisa检测试剂盒（晶美公司）；amv（逆转录酶），rna酶抑制剂、dntp，taq酶（promega公司）；rpmi 1640母液（gibico公司）；geneamp5700型hcvrna定量检测仪（美国abi公司）；au600肝功能检测仪（olympus公司）；其他试剂均购自北京中生公司产品.
1.2方法
1.2.1外周血pbmc的提取采用ficoll梯度离心法.
1.2.2pbmc体外培养后上清细胞因子的检测将分离所得pbmc用含有100 ml/l混合人血清的完全rpmi 1640培养液稀释细胞密度为5×109/l，以100 μl/孔加于96孔板，37℃，50 ml/l co2孵箱中培养，72 h后收集培养上清，-20℃冻存. 同时设不加细胞的阴性对照和加入cona(刀豆蛋白，2 mg/l)刺激的阳性对照.
1.2.3检测项目全部病例采用荧光定量pcr检测hcv rna滴度，肝功能检测由我院临床检验中心完成.
1.2.4血清hcv rna基因分型参照文献［4］进行. trizol提取血清中总rna，逆转录合成cdna，引物：5′atgtaccccatgaggtcggc3′. 巢式pcr进行rna分型鉴定. 第1轮pcr引物：正义：5′cgcgcgactaggaagacttc 3′；反义：5′atgtaccccatgaggtcggc3′，94℃变性1 min，55℃复性1.5 min，72℃延伸2 min，35个循环. 第2轮pcr以第1轮pcr产物为模板，使用同一个正义引物和4个型特异性反义引物，正义：5′aggaagac ttccgaggggtc3′，反义：5′tgccttggggataggctgac3′（ⅰ型，57 bp）；5′gagccatcctgcccacccca 3′（ⅱ型,144 bp）；5′ccaagagggacgggaaccta3′（ⅲ型,174 bp）；5′accctcgtttccgtacagag 3′（ⅳ,135 bp），94℃变性1 min，60℃复性1 min，72℃延伸1.5 min，30个循环. pcr产物15 g/l琼脂糖凝胶电泳鉴定.
统计学处理：用stata7.0软件进行统计学处理，两组间比较采用t检验.
2结果
2.1hcv感染患者pbmc体外培养72 h后th1类细胞因子的分泌培养72 h后，对照及所有hcv患者pbmc培养上清中均未检测到il2. hcv rna阴性（rna<106拷贝/l）患者ifnγ［（55±33） ng/l］较正常人［（34±14） ng/l ］和rna大于109拷贝/l的患者［（29±20） ng/l］明显增高（图1），而所有rna阳性患者与对照相比无显著差异. tnfα不论rna滴度高低均较对照显著增高；rna不同滴度的患者间无显著差异.
2.2不同hcv rna滴度情况下患者肝脏功能间的比较rna阳性患者alt，ast水平明显高于阴性患者（表1），其余肝脏功能指标两组患者间无明显差异.
2.3不同hcvrna基因型th1类细胞因子的分泌对34例hcv rna阳性患者进行hcv rna分型，21例ⅱ/1b（62%），5例ⅲ/2a（15%），8例（23%）未分出（表2）. 不论hcv rna为何种基因型，pbmc体外培养后ifnγ的分泌都较对照组无显著差异，而tnfα则均较对照组明显增高. 但各基因型之间ifnγ，tnfα均无显著差异.
图1在不同hcv rna滴度下的pbmc ifnγ和tnfα的分泌水平 略
表1不同hcv rna滴度情况下患者的肝脏功能（略）
表2不同的hcv rna基因型th1类细胞因子的分泌（略）
3讨论
虽然hcv感染后可诱导机体产生特异性的抗体，但hcv感染仍倾向于慢性化，可能原因是hcv在免疫压力的诱导下中和性表位发生变异，致使已产生的抗体不能中和病毒［5］. 因此，细胞免疫在hcv感染后的清除过程中可能起到决定性作用［6］. 有研究表明，在感染hcv后自发清除病毒的患者中，其体内th1类细胞因子（ifnγ，tnfα）的产生显著高于病毒持续存在的患者［7］. 此外，在hcv感染后不论是否清除病毒，均可诱导机体产生特异性的细胞免疫，但免疫应答的强度不足以清除病毒，从而致使病毒长期存在［8］.
ifnγ主要由nk细胞、cd8+t淋巴细胞、cd4+t淋巴细胞分泌，可增强抗原提呈细胞的吞噬能力，促进mhci，ii类抗原的表达、il12的分泌，诱导机体免疫应答向th1类分化［9］,同时其本身也具有抗病毒作用. 我们的实验表明，慢性hcv感染患者pbmc体外培养后，在hcvrna阴性（<106拷贝/l）患者中，ifnγ，tnfα的产生明显高于正常人，而在hcvrna阳性患者中，不论滴度的高低，tnfα均有所升高，但ifnγ的产生却与正常人无显著差异，且hcvrna滴度越高，ifnγ的产生越低. 这在一定程度上表明，ifnγ在病毒清除中起重要作用，细胞因子（ifnγ，tnfα）分泌的不平衡可能是导致病毒不能清除的原因之一.
细胞免疫在hcv感染中具有双重作用，hcv感染后诱导机体产生的th1类细胞因子（ifnγ，tnfα）虽然不足以清除病毒，但仍可诱导机体肝脏损伤［10］. ifnγ，tnfα同时具有抗病毒和明显的诱发炎症作用，在hcv感染后引起肝脏损伤中起重要作用. 我们的实验发现，在rna阳性患者中，代表肝脏炎症指标的alt，ast较rna阴性患者明显增高，且tnfα也较正常人明显增高，表明rna含量与病毒引起的肝脏损伤有一定关系，这可能由于在rna阳性患者中，由于ifnγ分泌不足，单独的tnfα升高表现为肝损伤为主，但不足以清除病毒. 而在rna阴性、肝功能正常的患者，虽然tnfα也明显增高，但ifnγ同时增高，二者一同起到了抗病毒的协同作用，体内病毒含量的减少使得肝脏炎症减轻. 另外，虽然rna阴性患者表现为alt，ast正常，但其诱导产生的免疫应答仍有可能造成损伤，肝脏炎症依然存在，病理检查将有助于进一步的明确.
在我国，hcv基因型ⅱ/1b，ⅲ/2a为主要感染病毒株，在我们的研究中基因型ⅱ/1b，ⅲ/2a占rna阳性患者的76%,各基因型之间ifnγ，tnfα的分泌均无显著差异，提示慢性hcv感染后诱导产生的免疫应答与基因型无关.
【参考文献】
［1］ mizukoshi e, rehermann b. immune responses and immunity in hepatitis c virus infection［j］. j gastroenterol， 2001， 36(12): 799-808.
［2］ thimme r, lohmann v, weber fa. target on the move: innate and adaptive immune escape strategies of hepatitis c virus［j］. antiviral res, 2006，69(3): 129–141.
［3］ 中华医学会传染病与寄生虫病学分会、肝病学分会. 病毒性肝炎防治方案［j］.中华肝脏病杂志, 2000， 8(6)：249-250.
［4］ hiroaki o, yasushi s, shunichi o, et al. typing hepatitis c rirus by polymerase chain reaction with typespecific primers: application to clinical surveys and tracing infectious sources［j］. j general virol, 1992， 73(3): 673-679.
［5］ pavio n, lai mm. the hepatitis c virus persistence: how to evade the immune system? ［j］. j biosci, 2003， 28(3): 287-304.
［6］ christie jm, healey cj, watson j, et al. clinical outcome of ypogammaglobulinemic patients following outbreak of acute hepatitis c: 2 year followup［j］. clin exp immunol, 1997， 110(1): 4-8.
［7］ rosen hr, miner c, lewinsohn d, et al. frequencies of hcvspecific effector cd4 t cells by flow cytometry: correlation with clinical disease stages［j］. hepatology, 2002， 35(1): 190-198.
［8］ rosen hr. hepatitis c pathogenesis: mechanisms of viral clearance and liver injury［j］. liver transplant, 2003， 9(11): s35-s43.
［9］ szabo sj, sullivan bm, peng sl, et al. molecularmechanisms regulating th1 immune responses［j］. annu rev immunol, 2003， 21: 713-758.
［10］ sun j, li k, shata mt, et al. the immunologic basis for hepatitis c infection［j］. curr opin gastroenterol, 2004， 20(6): 598-602.
