【摘要】 【目的】 观察低浓度马血清体外诱导成肌细胞ｃ２ｃ１２向成熟肌细胞分化、形成肌管的作用，探索定向诱导肌分化的途径及其分子机制。【方法】 将ｃ２ｃ１２成肌细胞用含不同浓度马血清的高糖ｄｍｅｍ培养基培养，收集细胞，在相差显微镜下观察形态变化，并通过免疫细胞化学（ｉｍｍｉｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｉｃｃ）及ｒｔ-ｐｃｒ方法分别检测肌性相关基因表达的改变。【结果】 ①２０ ｍｌ／ｌ和５０ ｍｌ／ｌ的马血清均能促使ｃ２ｃ１２细胞形成肌小管，２０ ｍｌ／ｌ浓度马血清诱导效率最好（第７天时肌小管形成率分别为３１．４％ ± ２．１％和１９．０％ ± １．６％，ｐ ＜ ０．００１）。②２０ ｍｌ／ｌ马血清诱导３～４ ｄ开始有肌管形成，之后肌管越来越多，到８～９ ｄ达高峰（第９天４０．２％ ± １．３％），往后细胞逐渐衰老死亡。③２０ ｍｌ／ｌ马血清诱导ｃ２ｃ１２细胞向成熟肌细胞分化过程中，肌相关蛋白分子表达发生变化：结蛋白（ｄｅｓｍｉｎ）、成肌分化抗原（ｍｙｏｄ）、生肌素（ｍｙｏｇｅｎｉｎ）和肌球蛋白（ｍｙｏｓｉｎ）等表达逐渐增强（未刺激时分别约为４９．６％ ± １．１％、２３．４％ ± １．１％、４．８％ ± １．６％和２．６％ ± １．５％；第６天时分别提高为８０．４％ ± １．８％、８５．４％ ± １．１％、２２．２％ ± １．１％和２６．０％ ± １．６％；ｐ ＜ ０．００１）；ｄｅｓｍｉｎ、ｍｙｏｄ和ｍｙｏｇｅｎｉｎ相应的ｍｒｎａ分子也可以通过ｒｔ-ｐｃｒ检测到。WwW.11665.coM【结论】 ①低浓度的马血清能够有效刺激ｃ２ｃ１２成肌细胞向成熟细胞分化，以２０ ｍｌ／ｌ浓度效果最好；②ｃ２ｃ１２细胞是研究肌细胞发育分化的理想模板；③肌分化发育过程比较复杂，许多因素都可能起影响，研究设计要尽量标准化。
【关键词】 成肌细胞； 肌细胞； 肌管； 定向分化； 基因表达
ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｉｎｄｕｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｃ２ｃ１２ ｍｙｏｂｌａｓｔｓ ｉｎｔｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｙｏｔｕｂｅｓ
ｃｈｅｎ ｙｏｎｇ-ｌｅ１， ｚｈｏｕ ｇｕａｎｇ-ｑｉａｎ２， ｄｅｎｇ ｙｕ-ｂｉｎ１， ｚｈｉ ｗｅｉ２，
ｘｉｅ ｈｕｉ-ｑｉ２， ｄｅｎｇ ｌｉ２， ｙａｎｇ ｚｈｉ-ｍｉｎｇ２， ｗａｎｇ ｙａ-ｚｈｕ１
（ １． ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ ｐａｔｈｏｌｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ， ｓｕｎ ｙａｔ-ｓｅｎ ｍｅｄｉｃａｌ ｓｃｈｏｏｌ， ｓｕｎ ｙａｔ-ｓｅｎ ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１００８９， ｃｈｉｎａ； ２． ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ｈｕａｘｉ ｈｏｓｐｉｔａｌ， ｓｉｃｈｕａｎ ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， ｃｈｅｎｇｄｕ ６１００４１， ｃｈｉｎａ ）
ａｂｓｔｒａｃｔ： 【ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ】 ｔｏ ｏｂｓｅｒｖｅ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｌｏｗ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｈｏｒｓｅ ｓｅｒｕｍ ｏｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｃ２ｃ１２ ｍｙｏｂｌａｓｔｓ ｉｎｔｏ ｍａｔｕｒｅ ｍｙｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｔ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｙｏｔｕｂｅｓ， ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ ｍｙｏｇｅｎｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ． 【ｍｅｔｈｏｄｓ】 ｔｈｅ ｃ２ｃ１２ ｍｙｏｂｌａｓｔｓ ｗｅｒｅ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｉｎ ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ-ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｄｍｅｍ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｗｉｔｈ ｖａｒｉｏｕｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｈｏｒｓｅ ｓｅｒｕｍ， ｔｈｅｎ ｈａｒｖｅｓｔｅｄ ａｎｄ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｐｈａｓｅ ｃｏｎｔｒａｓｔ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ａｐｐｅａｒａｎｃｅ， ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ｍｕｓｃｌｅ-ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ ｂｙ ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｒｔ-ｐｃｒ ａｓｓａｙｓ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． 【ｒｅｓｕｌｔｓ】 （１）ｂｏｔｈ ２０ ｍｌ／ｌ ａｎｄ ５０ ｍｌ／ｌ ｈｏｒｓｅ ｓｅｒｕｍ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｍｙｏｔｕｂｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｃ２ｃ１２ ｍｙｏｂｌａｓｔｓ， ｏｆ ｗｈｉｃｈ ｔｈｅ ２０ ｍｌ／ｌ ｈｏｒｓｅ ｓｅｒｕｍ ｈａｄ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｒ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ （ｏｎ ｄａｙ ７， ｔｈｅ ｒａｔｉｏｓ ｏｆ ｍｙｏｔｕｂｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｂｏｔｈ ｇｒｏｕｐｓ ａｒｅ ３１．４％ ± ２．１％ ａｎｄ １９．０％ ± １．６％， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ， ｐ ＜ ０．０００１）． （２）ｉｎｄｕｃｅｄ ｗｉｔｈ ２０ ｍｌ／ｌ ｈｏｒｓｅ ｓｅｒｕｍ ｆｏｒ ３－４ ｄａｙｓ， ｍｙｏｔｕｂｅｓ ｓｔａｒｔｅｄ ｔｏ ｆｏｒｍ． ｌａｔｅｒ ｏｎ， ｍｏｒｅ ａｎｄ ｍｏｒｅ ｍｙｏｔｕｂｅｓ ａｐｐｅａｒ， ａｎｄ ａｔ ｔｈｅ ｐｅａｋ ｏｎ ８－９ ｄａｙｓ （ｄａｙ９， ｔｈｅ ｍｙｏｔｕｂｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ ｗａｓ ４０．２％ ± １．３％）． ａｆｔｅｒ ｔｈａｔ， ｔｈｅ ｃｅｌｌｓ ｇｒａｄｕａｌｌｙ ｇｏｔ ｓｅｎｉｌｅ ａｎｄ ｅｎｄ ｉｎ ｄｅａｔｈ． （３）ｉｎ ｔｈｅ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｒｏｍ ｃ２ｃ１２ ｔｏ ｍｙｏｃｙｔｅｓ ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ ｂｙ ２０ ｍｌ／ｌ ｈｏｒｓｅ ｓｅｒｕｍ， ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｕｓｃｌｅ-ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｃｈａｎｇｅｄ： ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｏｆ ｄｅｓｍｉｎ， ｍｙｏｄ， ｍｙｏｇｅｎｉｎ， ａｎｄ ｍｙｏｓｉｎ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｇｒａｄｕａｌｌｙ（ｐｒｉｏｒ ｔｏ ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ， ｔｈｅｉｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｒａｔｉｏｓ ｗｅｒｅ ４９．６％ ± １．１％， ２３．４％ ± １．１％， ４．８％ ± １．６％， ａｎｄ ２．６％ ± １．５％， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ； ｏｎ ｄａｙ ６， ｕｐ ｔｏ ８０．４％ ± １．８％， ８５．４％ ± １．１％， ２２．２％ ± １．１％， ａｎｄ ２６．０％ ± １．６％， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ； ｐ ＜ ０．００１）， ｏｆ ｗｈｉｃｈ ｔｈｅ ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔ ｍｒｎａｓ ｏｆ ｄｅｓｍｉｎ， ｍｙｏｄ， ａｎｄ ｍｙｏｇｅｎｉｎ ｃｏｕｌｄ ａｌｓｏ ｂｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｒｔ-ｐｃｒ． 【ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ】 （１）ｌｏｗ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｈｏｒｓｅ ｓｅｒｕｍ ｉｓ ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｃ２ｃ１２ ｍｙｏｂｌａｔｓ ｔｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ ｉｎｔｏ ｍａｔｕｒｅ ｍｙｏｃｙｔｅｓ， ｏｆ ｗｈｉｃｈ ｔｈｅ ２０ ｍｌ／ｌ ｈｏｒｓｅ ｓｅｒｕｍ ｂｅａｒｓ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｒ ｅｆｆｅｃｔ． （２）ｃ２ｃ１２ ｃｅｌｌｓ ａｒｅ ａｎ ｏｐｔｉｍａｌ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ ｍｙｏｇｅｎｉｃ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ． （３）ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ｍｕｓｃｌｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｓ ｃｏｍｐｌｉｃａｔｅｄ， ｉｎ ｗｈｉｃｈ ｔｏｏ ｍａｎｙ ｆａｃｔｏｒｓ ａｒｅ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｗｉｔｈ． ｓｏ， ｔｈｅ ｄｅｓｉｇｎ ｓｈｏｕｌｄ ｂｅ ｍａｄｅ ｉｎ ａ ｓｔａｎｄａｒｄ ｗａｙ．
ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｍｙｏｂｌａｓｔ； ｍｙｏｃｙｔｅ； ｍｙｏｔｕｂｅ； ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉｏｎ； ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
诱导肌干细胞（ｍｙｏｇｅｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）向肌细胞定向分化进行移植是治疗ｄｍｄ（ｄｕｃｈｅｎｎｅ蒺ｓ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、 心肌梗死以及肌肉先后天缺损等疾病最有希望的方法之一。肌卫星细胞是主要的肌干细胞，是肌再生修复的主要种子细胞。它们存在于成熟肌纤维的浆膜和基膜之间，表达早期肌系特异性因子ｐａｘ３、ｐａｘ７和ｃ-ｍｅｔ，不表达结蛋白（ｄｅｓｍｉｎ）、成肌分化抗原（ｍｙｏｇｅｎｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ， ｍｙｏｄ）、生肌素（ｍｙｏｇｅｎｉｎ）和 肌球蛋白（ｍｙｏｓｉｎ）等肌系中晚期分子。肌卫星细胞也表达ｃｄ３４分子，经激活不同程度表达ｄｅｓｍｉｎ、ｍｙｏｄ、ｍｙｆ-５、ｍｙｏｓｉｎ 和ｍ-钙黏附分子（ｍ-ｃａｄｈｅｒｉｎ）等分子［１－６］。对肌干细胞的肌定向诱导研究仍存在不少问题，主要有机制不清楚、诱导分化率低、分化一致性差、结果不稳定、生成的肌细胞功能缺陷等，故需要进一步研究。ｃ２ｃ１２细胞是由ｃ３ｈ小鼠骨骼肌卫星细胞永生化而来的细胞株，因为细胞形态和特性均一，可无限代培养，因此常常被用做肌系细胞发育分化研究的模板［１，６－９］。本研究以ｃ２ｃ１２成肌细胞为研究对象，尝试应用不同浓度马血清和牛血清进行体外培养，诱导其向成熟肌细胞分化，并进行定性证明，揭示肌发育分化过程一些肌特征性分子的表达情况，探索向肌细胞定向分化的诱导途径，为临床治疗肌性疾病的应用打下实验基础。
１ 材料与方法
１．１ 细 胞
小鼠肌卫星细胞株ｃ２ｃ１２（为英国贝尔法斯特女王大学肿瘤研究和细胞生物学中心所保存，在含１００ ｍｌ／ｌ牛血清的高糖ｄｍｅｍ培养基中增殖性生长）。
１．２ 主要试剂
高糖ｄｍｅｍ培养基和马血清（均为ｇｉｂｃｏ公司产品），ｆｂｓ血清（ｈｙｃｌｏｎｅ公司产品），ｔｎｅ（５ ｇ／ｌ胰酶 ＋ ０．２ ｇ／ｌ ｅｄｔａ，四川大学华西临床医院实验中心干细胞与组织工程研究室自配），鼠抗ｍｙｏｄ抗体、鼠抗ｍｙｏｓｉｎ抗体、鼠抗ｍｙｏｇｅｎｉｎ抗体、兔抗ｐａｘ７抗体、鼠抗ｄｅｓｍｉｎ抗体（均为ｓｉｇｍａ公司产品），ｄａｂ显色试剂盒（购自武汉博士德生物工程有限公司），ｒｔ-ｐｃｒ试剂盒（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司产品），ｔｒｉｚｏｌ和ｄｅｐｃ（均为ｓｉｇｍａ公司产品）。
１．３ ｐｃｒ引物
根据文献报道得到ｐａｘ７、ｄｅｓｍｉｎ、ｍｙｏｄ、ｍｙｏｇｅｎｉｎ、ｍｒｆ４（ｍｕｓｃｌｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ ４，肌调节因子４）和ｇａｐｄ分子的引物序列［１０］，然后在ｗｗｗ．ｐｕｂｍｅｄ．ｂｌａｓｔ中验证。引物由上海ｇｅｎｅｒａｙ ｂｉｏｔｅｃｈ公司合成。
１．４ 方 法
１．４．１ ｃ２ｃ１２细胞增殖培养 复苏ｃ２ｃ１２细胞，用含１００ ｍｌ／ｌ ｆｂｓ血清的高糖ｄｍｅｍ培养基调节细胞浓度为５ × １０３／ｍｌ，移入培养瓶中，置３７ ℃，体积分数５％ｃｏ２的孵箱中培养，隔２ ｄ换液，观察细胞形态和生长情况。
１．４．２ ｃ２ｃ１２细胞诱导肌分化培养 用ｔｎｅ消化增殖培养达９０％ ～ １００％融合的ｃ２ｃ１２细胞，用含２０ ｍｌ／ｌ、５０ ｍｌ／ｌ ｆｂｓ或２０ ｍｌ／ｌ、５０ ｍｌ／ｌ、１００ ｍｌ／ｌ马血清的高糖ｄｍｅｍ培养基调节细胞浓度为５ × １０４／ｍｌ，置３７ ℃，体积分数５％ｃｏ２的孵箱中培养，观察细胞形态和生长情况，特别注意是否肌管出现。细胞在２５ ｍｌ的培养瓶培养，每瓶计１个样品，使用时每个样品细胞数达１ × １０６～３ × １０６。不同浓度组分别设３个复瓶。
１．４．３ ｇｉｍｓａ染色并显微镜下观察 和１．４．２步骤一样爬片培养ｃ２ｃ１２细胞，按四川大学华西临床医院实验中心干细胞与组织工程研究室方法进行ｇｉｍｓａ染色，观察细胞形态和生长情况，特别注意是否肌管出现。
１．４．４ 细胞免疫化学检测细胞肌性蛋白分子表达 常规制作经肌分化诱导的ｃ２ｃ１２细胞不同时期（经２０ ｍｌ／ｌ马血清培养ｄ０，ｄ３，ｄ６ ３个时间点）的细胞爬片，经４０ ｇ／ｌ多聚甲醛固定之后按试剂盒的使用说明行ｄａｂ免疫细胞化学染色，观察、计算阳性率。细胞在６孔板培养，每个爬片计１个样品，使用时每个样品细胞数达３ × １０５ ～ ５ × １０５。每个时间点设１个组，分别设３个复孔。
１．４．５ ｒｔ-ｐｃｒ检测细胞肌性ｍｒｎａ分子表达 细胞在２５ ｍｌ的培养瓶培养，每瓶计１个样品，使用时每个样品细胞数达１ × １０６ ～ ３ × １０６。２０ ｍｌ／ｌ马血清诱导的ｄ０和ｄ６分别设１组，每组分别设３个复瓶。
①ｒｎａ提取及纯化：用ｔｒｉｚｏｌ溶解ｃ２ｃ１２或ｃ２ｃ１２经诱导分化的细胞，按常规方法提取纯化ｒｎａ，５７ ℃孵育１０ ｍｉｎ，取适量上分光光度计测纯度和总量。
②逆转录反应（ｒｔ）：按括弧内体系加入各成分［总体积２５ μｌ：１０×ｐｃｒ ｂｕｆｆｅｒ ２．５， ｍｇｃｌ２ ５．０， ｄｎｔｐ ｍｉｘｔｕｒｅ ２．５， ｒｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｅｒ ０．５， ａｍｖ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｓｅ ｘｌ ０．５， ｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｒ ｐａｉｒｓ（ｆ＋ｒ） ０．５， ｒｎａ ｓａｍｐｌｅ ２．５， ｒｎａｓｅ ｆｒｅｅ ｈ２ｏ １１．０］并混匀，按５０ ℃反应５０ ｍｉｎ，接着转入９５ ℃反应２ ｍｉｎ，共１个循环进行ｒｔ反应得到ｃｄｎａ，保存于４ ℃中待用。
③多聚合酶链反应（ｐｃｒ）：按括弧内体系［总体积２５ μｌ：ｐｒｅｍｉｘ ｔａｑ １２．５，双蒸水 ９．５，ｐｒｉｍｅｒ ｐａｉｒｓ（ｆ＋ｒ） １．０， ｃｄｎａ ２．０， ｇａｄｐ（内参照）０．６］加入各样本，混匀然后按如下的设定上ｐｃｒ仪扩增目的基因：９５ ℃变性２ ｍｉｎ 共１个循环，然后执行（９５ ℃变性３０ ｓ，接着６０ ℃退火４５ ｓ，最后７２ ℃延伸１ ｍｉｎ ３０ ｓ）３５个循环，接着７２ ℃再延伸１０ ｍｉｎ，结束反应，保存于４ ℃待用。
将ｒｔ-ｐｃｒ终产物上１２ ｇ／ｌ琼脂糖凝胶中电泳，电泳结束后在自动成像系统中观察并拍照。
１．４．６ 统计学分析 应用ｓｐｓｓ软件进行两个样品均数比较的ｔ检验分析，检验水准α＝０．０５。
２ 结 果
２．１ ｃ２ｃ１２细胞增殖培养
细胞在含１０ ｍｌ／ｌ的ｆｂｓ血清的高糖ｄｍｅｍ培养基中培养，开始稀疏时细胞形态呈梭状，均一。细胞生长较快，３ ～ ４ ｄ基本达完全融合。随着密度增加，细胞相互挤压，形态由梭状逐渐变长变细，呈纤维状，最后慢慢衰老死亡。包括ｇｉｍｓａ染色，整个过程极少见细胞融合，没有肌小管出现（图１ａ － ｄ）。减少培养基中ｆｂｓ浓度，由１００ ｍｌ／ｌ降为５０ ｍｌ／ｌ甚至是２０ ｍｌ／ｌ，细胞生长进一步减慢，但形态保持不变。
２．２ ｃ２ｃ１２细胞诱导肌分化培养
ｃ２ｃ１２肌前体细胞在含２０ ｍｌ／ｌ浓度马血清的高糖ｄｍｅｍ中培养，约３ ～ ４ ｄ后显微镜下开始观察到细胞的融合出现，发现肌管形成，随着时间推移，细胞密度变大变长，细胞融合越来越多，可以见到许多有两个核以上象串珠似的肌管出现（图２ａ － ｅ），到第８～９天达高峰（第９天为 ４０．２％ ± １．３％），之后细胞逐渐衰老死亡。５０ ｍｌ／ｌ马血清也有同样肌分化诱导作用，但速度要慢２ ～ ３ ｄ，效果也明显低于２０ ｍｌ／ｌ浓度（第７天时肌小管形成率分别为：３１．４％ ± ２．１％和１９．０％ ± １．６％，ｐ ＜ ０．００１）。１００ ｍｌ／ｌ马血清没有观察到肌诱导分化作用。
２．３ ｃ２ｃ１２肌前体细胞向肌细胞分化过程肌相关蛋白分子表达
免疫细胞化学检测发现，ｃ２ｃ１２细胞未经２０ ｍｌ／ｌ马血清刺激（ｄ０）时ｄｅｓｍｉｎ和ｍｙｏｄ表达较高阳性率（分别约为：４９．６％ ± １．１％、２３．４％ ± １．１％。图３ａ，ｂ），而ｍｙｏｇｅｎｉｎ和ｍｙｏｓｉｎ虽表达，但表达率很低（分别约为：４．８％ ± １．６％和２．６％ ± １．５％，图３ ｃ，ｄ）。２０ ｍｌ／ｌ马血清刺激一段时间后，经２０ ｍｌ／ｌ马血清刺激６ ｄ，ｄｅｓｍｉｎ、ｍｙｏｄ、ｍｙｏｇｅｎｉｎ和ｍｙｏｓｉｎ表达都有明显提高（表达阳性率分别约为：８０．４％ ± １．８％，８５．４％ ± １．１％，２２．２％ ± １．１％，２６．０％ ± １．６％； ｐ ＜ ０．００１。图４ａ－ｄ）。
２．４ ｃ２ｃ１２肌前体细胞向肌细胞分化过程肌相关ｍｒｎａ分子表达
进行ｒｔ-ｐｃｒ首先要得到优质的总ｒｎａ，本实验抽提到的ｒｎａ产物ａ２６０／２８０比值都在１．６到２．２之间，并获得了较高的量。做ｒｔ-ｐｃｒ检测，未经诱导的ｃ２ｃ１２细胞ｄｅｓｍｉｉｎ、ｍｙｏｄ和ｍｙｏｇｅｎｉｎ表达，ｄｅｓｍｉｎ和ｍｙｏｄ有一定程度表达，ｍｙｏｇｅｎｉｎ表达很微弱，其余（ｐａｘ７、和ｍｆｒ４）均未检测到ｍｒｎａ表达。细胞经过含２０ ｍｌ／ｌ的马血清的高糖ｄｍｅｍ ６ ｄ培养，发现ｄｅｓｍｉｎ和ｍｙｏｄ表达最强，ｍｙｏｇｅｎｉｎ仍保持微弱表达，而ｐａｘ７和ｍｆｒ４仍然未检测到ｍｒｎａ表达（图５）。
３ 讨 论
在肌卫星细胞向肌细胞发育分化过程中，细胞出现融合，形成肌管、肌纤维，甚至可见肌细胞的搏动［１１］。相应地，一些肌性标志性分子表达发生变化。早期的分子表达有ｐａｘ３，ｓｉｘ１，ｓｉｘ４等，ｐａｘ７，ｃ-ｍｅｔ接着出现，跟着的是ｍｙｏｄ，ｍｙｏｇｅｎｉｎ，ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ，ｄｅｓｍｉｎ等，ｍｙｆ６，ｍｒｆ，ｍｙｏｓｉｎ和β-ａｃｔｉｎ在分化终末期出现［１１，１２］。
３．１ 低浓度血清刺激ｃ２ｃ１２细胞向成熟肌细胞分化
低浓度血清能够刺激肌干细胞向成熟肌细胞分化［１３，１４］。我们只观察到低浓度马血清有刺激ｃ２ｃ１２肌分化作用，低浓度ｆｂｓ没有该效能。无血清培养下，细胞生长缓慢，细胞密集时也可见数量有限的肌小管融合形成。马血清中可能含有某种有利于启动肌前体细胞向成熟肌细胞分化的因子，低浓度血清本身能刺激血清反应因子（ｓｒｆｓ）产生，因此低浓度马血清能有效诱导肌干细胞沿肌系下游分化。但是ｙｏｓｈｉｋｏ ｙ等［１５］发现，高浓度血清也有诱导ｃ２ｃ１２的肌分化作用，高峰值更高，只是作用出现延迟。理由是，高浓度血清刺激ｃ２ｃ１２自分泌和旁分泌ｉｇｆ因子，刺激肌分化更甚于血清的有丝分裂原的分化抑制作用。分析我们用低浓度ｆｂｓ诱导ｃ２ｃ１２肌分化失败的原因，可能也是延迟出现而已，只是我们没观察到。这也说明，肌分化诱导结果受许多因素影响，实验设计要尽量标准化。
本实验观察到，永生化的肌卫星细胞ｃ２ｃ１２在１００ ｍｌ／ｌ牛血清的高糖ｄｍｅｍ中没有形态的改变，经低浓度马血清诱导后可*、稳定地向成熟肌细胞分化，形成肌管，但没有肌纤维，未见肌细胞搏动。相反，原代肌细胞在含１００ ｍｌ／ｌ牛血清的低糖ｄｍｅｍ培养基中培养两周左右会出现肌纤维和肌细胞搏动。原因可能是肌原代细胞中含有肌分化更晚的早期细胞，容易在体外培养被激发，形态和功能也能够保持。而ｃ２ｃ１２可能处于更早阶段，２０ ｍｌ／ｌ马血清只能在形态而不能在功能诱导上起作用。
３．２ 与低浓度血清诱导ｃ２ｃ１２向肌管分化相关的一些肌调节因子表达
文献报道［５，１６］，未经刺激的ｃ２ｃ１２有少量ｄｅｓｍｉｎ、ｍｙｏｄ和ｍｙｏｇｅｎｉｎ表达，刺激后表达明显增加。本实验中，增殖培养下，ｃ２ｃ１２成肌细胞表达一定量的ｄｅｓｍｉｎ、ｍｙｏｄ和少量的ｍｙｏｇｅｎｉｎ。分化诱导培养后，ｄｅｓｍｉｎ和ｍｙｏｄ表达明显上调，但ｍｙｏｇｅｎｉｎ还保持少量水平。ｐａｘ７和ｍｒｆ４，不管在蛋白水平还是ｍｒｎａ水平都未检测到表达，这与文献报道不一致［１２，１７］，可能是受某些影响的结果。ｐａｘ７是转录子，在增殖和静止的肌卫星细胞（包括ｃ２ｃ１２）均有表达。它在肌转化作用中作用较弱，因此，估计可能是ｐａｘ７分子表达低的缘故，可能与检测不够灵敏也有关。另外原因可能因为ｐａｘ７只在比ｃ２ｃ１２更早阶段的肌干细胞表达［３，１２，１７］。ｔｅ ｐａｓ ｍｆ等［１８］用激素刺激ｃ２ｃ１２，发现对细胞增殖和分化均有抑制；但是对ｍｙｏｄ、ｍｙｆ５和ｍｒｆ４表达水平都起上调作用，而对ｍｙｏｇｅｎｉｎ均起下调作用。与其它文献报道不一致，因为ｍｙｏｇｅｎｉｎ在ｍｙｏｄ等下游，ｍｙｏｄ高则ｍｙｏｇｅｎｉｎ高［５］。结合我们研究，说明细胞分化受许多方面影响，如细胞种类、发育时期、受刺激的方向等［１９］。
肌干细胞体外发育分化受刺激因素、干细胞本身所处阶段等多因素影响，因此，诱导分化的路径、分化过程相伴随的分子的表达以及细胞形态功能等生物学特征差别较大，有许多方面需进一步探明。想获得高效、稳定、均一的成熟肌细胞用于研究或临床治疗必须尽可能选用高效途径，公式化作用模式，排除干扰因素。
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