高能x射线对肺腺癌a549细胞ercc1表达的影响
【关键词】 肺肿瘤；a549细胞；切除修复交叉互补基因1；x线疗法
【摘要】 目的 检测高能x射线对肺腺癌a549细胞与顺铂耐药相关的基因——切除修复交叉互补基因1（ercc1）表达的影响。方法 对a549细胞进行x射线照射，总剂量10 gy／(5 d·5f)。利用rtpcr检测照射前及照射开始后第1～4周细胞的ercc1基因的表达；免疫组织化学sabc法检测照射前后细胞ercc1蛋白的表达。结果 照射后第1～3周a549细胞ercc1 mrna及蛋白的表达水平比照射前显著升高，差异有显著性(f=152.00、26.63,q=6.03～28.31,p<0.01)。结论 肺腺癌a549细胞照射后可能出现顺铂耐药。
【关键词】 肺肿瘤；a549细胞；切除修复交叉互补基因1；x线疗法
effect of highenergy xray on ercc1 expression in lung adenocarcinoma a549 cells
wang yufang, liu xiguang, yin hongmei, et al
(department of oncology, the affiliated hospital of qingdao university medical college, qingdao 266003, china);
［abstract］ objective to study the highenergy xray on expression of ercc1 gene associated with cisplatin resistance in human lung adenocarcinoma a549 cell. methods the a459 cells were exposed to xray with a total dose of 10 gy/(5 d·5 f). the expression of ercc1 before and during 1-4week radiation was detected by rtpcr, and that before and after exposure of xray was detected by immunohistochemistry (sabc method). results on the first to third week of irradiation, the expressions of ercc1 mrna and protein were significantly higher than that before exposure (f=152.00,26.63;q=6.03-28.31;p<0.01). conclusion a549 cells may show cisplatin resistant after radiation.
［key words］ lung tumor; a549 cell; excision repair crosscomplementation group 1; xray therapy
肺癌是世界范围内最为常见的恶性肿瘤之一，其中非小细胞肺癌（nsclc）约占80％，而约2/3的nsclc病人在发现时已失去手术机会， 故放化疗综合治疗已成为该类肿瘤常用的治疗手段。Www.11665.COm再次或多次化疗可以诱导多药耐药导致肿瘤的化疗敏感性降低已无异议，但目前关于放疗后耐药基因及其蛋白表达情况以及相应的放疗对化疗敏感性的影响方面的研究较少,结果也不一致。因此，有针对性地对其研究十分必要。目前含铂方案是nsclc一线标准化疗方案。研究结果证实，ercc1可作为铂类药物化疗效果的独立预测指标[15]。本实验针对体外培养的肺腺癌a549细胞株,检测高能x射线照射前后与顺铂耐药相关的基因——切除修复交叉互补基因1（ercc1）及其编码产物的表达随时间变化情况，探讨照射与肺腺癌a549细胞顺铂耐药性的关系。现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 细胞培养
人肺腺癌细胞株a549由中国科学院上海生物学研究所提供。培养于含有体积分数0.10的小牛血清、10×104u/l的青霉素及10×104 g/l链霉素的rpmi 1640培养液中，置于37 ℃、体积分数0.05 co2及饱和湿度的培养箱中传代培养。待细胞生长至指数生长期时进行x射线照射。
1.2 照射方法
照射源为直线加速器(varian 23ex，美国)，采用6 mv的x射线，源皮距为100 cm。细胞每次照射剂量为2 gy，每天1次，总剂量10 gy。剂量率为300 cgy/min。射野大小为15 cm×15 cm。把培养瓶置于照射野中心，每次照射后放回培养箱继续培养，全部照射结束后，每隔1周取对数生长期的细胞冻存，用于rtpcr和sabc法检测，每组实验重复3次。
1.3 rtpcr检测ercc1 mrna的表达
按trizol试剂盒(购自美国invitrogen公司)说明书及rtpcr试剂盒（购于大连宝生物工程有限公司）说明书的方法提取总细胞rna，反转录合成cdna。ercc1引物序列为：正向引物5′acccctcgacgaggatga3′,反向引物 5′gatggcatattcggcgtaggt3′，扩增片断长度为127 bp。内参照βactin扩增片段长约为621 bp， 引物序列为：前向引物5′acactgtgcccatctacgagg3′， 反向引物5′agggccggactcgtcatact3′。上述ercc1及内参照βactin引物均由上海生工生物工程有限公司合成。逆转录总反应体系为20 μl，反应条件为：37 ℃ 5 min后，42 ℃ 1 h，72 ℃ 10 min。pcr反应体系为50 μl，反应条件为：94 ℃预变性5 min;然后94 ℃变性30 s，60℃退火30 s，72 ℃ 复性65 s，共35个循环;最后72 ℃充分延伸10 min后终止反应。取产物于15 g/l的 琼脂糖凝胶上电泳。以βactin作为内标，扩增产物长为621 bp，将标本的ercc1扩增产物平均吸光度与内标的平均吸光度值相比，以比值作半定量分析。
1.4 ercc1蛋白表达sabc法检测
x射线照射前对未进行处理的肺腺癌a549细胞，直接用免疫组织化学sabc法检测ercc1蛋白的表达。细胞株在x射线照射后经换液、传代在1～4周检测ercc1蛋白的表达。操作步骤按试剂盒说明书进行，鼠抗人ercc1单抗试剂盒(labvision，美国)为1∶50浓缩液。 ercc1阳性表现为细胞核内出现棕黄色颗粒沉淀。照射前及照射后各时间点各选1张细胞分布比较均匀、细胞稠密适当的细胞爬片。每张爬片随机选取5个高倍视野，每个视野计数100个细胞，计算阳性细胞占细胞总数的百分率。
1.5 统计学分析
采用ppms 1.5[6]统计软件进行统计分析。所得数据均以±s表示，各组间两两比较采用lsdt检验。
2 结果
2.1 rtpcr检测ercc1 mrna表达
照射前及照射1～4周ercc1 mrna表达分别为0.21±0.04、0.43±0.03、0.70±0.02、0.52±0.03和0.20±0.06，照射后第1～3周细胞ercc1 mrna的表达水平比照射前显著升高，差异有显著性(f=152.00,q=12.76 ～28.31,p<0.01)。第4周与照射前相比差异无显著性（p>0.05）。
2.2 sabc法检测ercc1蛋白的表达
照射前及照射1～4周ercc1蛋白的表达分别为（33.02±7.55）%、（51.02±8.59）%、（71.96±6.50）%、（59.33±7.00）%及(39.96±5.42)%，照射后第1～3周细胞ercc1蛋白的表达与照射前比较，差异有显著性(f=26.63，q=6.03～13.06，p<0.05)。照射后4周时，与照射前比较差异无显著性(p>0.05)。
3 讨论
ercc1是一种高度保守的单链dna核酸内切酶，位于染色体19q13.213.3，基因长度约为15 kb，其含有10个外显子，编码含297个氨基酸的蛋白质。ercc1基因表达产物与dna修复酶缺乏互补基因f(xpf)形成紧密异二聚体(ercc1xpf)，该二聚体是一种特异性的连结5′端的核酸内切酶，具有损伤识别和切除5′端的双重作用。研究结果显示，nsclc中存在ercc1表达，表达率为35％(22/63)[7]，本文实验结果与之相似。说明该细胞本身就对顺铂有低度耐药。照射后，细胞ercc1 mrna及蛋白表达在一定时间内均比照射前显著增高，说明放射治疗也可引起肺腺癌a549细胞的顺铂耐药，因此应注意放射治疗对肿瘤化疗耐药的影响。其机制可能与照射后ercc1表达增高与照射引起的dna损伤后修复有关。照射一定时间后ercc1基因及蛋白表达又有回落，提示应避免在耐药基因及蛋白表达水平较高时给予化疗药物治疗，避免因放疗诱导的顺铂耐药，降低肿瘤综合治疗效果。另一方面提示放疗联合ercc1 mrna的靶向治疗可能会取得更理想的抗肿瘤效应。
铂类和第三代抗肿瘤新药，如紫杉醇、多西紫杉醇、盐酸吉西他滨的二联作为目前肿瘤一线标准化疗方案，但并不代表为最合理的治疗方案。标准化疗方案治疗晚期nsclc病人疗效差异较大，基于分子分型基础上的个体化化疗是目前研究热点之一。药物基因组学研究的个体化用药选择，是肺癌个体化治疗研究的前沿，不同药物效应预测分子可影响肺癌对不同化疗药物的反应。目前几组根据不同相关药物效应预测分子，如ercc1、rrm1、β2微管蛋白ⅲ表达水平选择不同化疗方案的ⅲ期临床试验正在进行中。我们实验室也正在并陆续研究了放疗后β2微管蛋白ⅲ、rrm1、xpd、xrcc1、brca1等的表达，以进一步指导放疗后个体化治疗。
当然，本研究毕竟只是体外实验，旨在对临床体内治疗的方案提供理论参考，考虑到癌细胞组织来源不同，细胞体内外生存环境的不同，照射方式、选取检测的时间点、检测指标的不同，体内肿瘤病灶受病人的身体状况、肿瘤的病理类型、病期等影响。照射后其耐药基因及蛋白的表达程度可能也存在一定的差异。这些问题尚待进一步研究。
【参考文献】
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