基金项目：国家自然科学基金资助项目(no.30370464)；陕西省科技攻关项目(no.2005k13g6)
【摘要】 目的 观察单侧黑质纹状体通路损毁对大鼠丘脑网状核神经元电活动的影响。方法 采用在体细胞外记录方法研究正常大鼠和帕金森病(parkinson’s disease, pd)模型大鼠丘脑网状核(trn)γ氨基丁酸(gaba)能神经元放电频率和放电形式的变化。结果 对照组和pd组大鼠trn神经元的放电频率分别是(14.7±1.6)hz (n=23)和(33.8±3.0)hz(n=29)，pd组大鼠trn神经元的放电频率显著高于对照组(p<0.001)。在对照组大鼠，17%的神经元呈现不规则放电，83%为爆发式放电；而在pd组大鼠，具有规则、不规则和爆发式放电的神经元比例分别为7%、45%和48%，爆发式放电的神经元比例明显低于对照组(p<0.05)。结论 单侧黑质纹状体通路损毁诱发大鼠trn内gaba能神经元的放电频率增高，爆发式放电减少，这种变化可能与皮质trn兴奋性神经传递增强和苍白球trn抑制性神经传递减弱有关。
【关键词】 丘脑网状核；帕金森病；γ氨基丁酸；电生理学；大鼠
unilateral lesion of the nigrostriatal pathway changes the neuronal activity of the reticular thalamic nucleus in the rat
zhang qiaojun, liu jian, liu yaping, yuan haifeng, gao rui, xiang li
(department of neurology, the second affiliated hospital, medical school of xian jiaotong university, xian 710004; department of physiology and pathophysiology,medical school of xian jiaotong university, xian 710061, china)
abstract: objective to investingate the changes in neuronal activity of the thalamic reticular nucleus (trn) following the unilateral lesion of the nigrostriatal pathway. methods the changes in the firing rate and firing pattern of the trn gabaergic neurons were examined with extracellular recording methods in control and parkinsons disease (pd) rats. results the results showed that the firing rates of trn neurons in control and pd rats were 14.7±1.6hz (n=23) and 33.8±3.0hz (n=29), respectively, and the firing rate of trn neurons in pd rats was significantly increased when compared to that of control rats (p<0.001). in control rats, 17% of the neurons fired irregularly and 83% in bursts. in pd rats, 7% of the neurons fired regularly, 45% irregularly and 48% in bursts, the percentage of the neurons firing in bursts being siginificant lower than that of control rats (p<0.05). conclusion unilateral lesion of the nigrostiatal pathway induces an increase of the firing rate on the trn gabaergic neurons and a decrease of the percentage of the neurons firing in bursts, suggesting that the changes may be associated with the increase of the corticaltrn excitatory neurotransmission and decrease of the globus pallidustrn inhibitory neurotransmission.
key words: thalamic reticular nucleus; parkinsons disease; γaminobutyric acid; electrophysiology; rat
丘脑网状核(thalamic reticular nucleus, trn)位于背侧丘脑的前外侧面，主要由γ–氨基丁酸(γaminobutyric acid, gaba)能神经元组成，与丘脑、皮质有广泛的纤维联系。WwW.11665.CoM因此，trn影响丘脑和皮层之间的神经信息传递，参与感觉、运动和边缘系统功能活动的调节[1]。研究发现trn与帕金森病(parkinson’s disease, pd)的静止性震颤有密切关系。trn也接受来自基底神经节的纤维投射，特别是来自苍白球和黑质网状部的投射[2]。苍白球是基底神经节环路间接通路中的一个重要核团，影响丘脑底核的活动；而黑质网状部是基底神经节环路的一个输出核，其gaba能传出抑制丘脑和皮质的活动[3]。电生理学研究也发现刺激黑质或腹侧苍白球能够改变trn神经元的电活动[34]。然而黑质致密部多巴胺能神经元的变性导致苍白球和黑质网状部神经活动的改变，这种变化如何影响trn神经元的活动目前尚不清楚。因此，在本研究中我们以6羟多巴胺(6hydroxydopamine, 6ohda)pd模型大鼠为对象，采用玻璃微电极细胞外记录方法，观察pd模型大鼠trn中gaba能神经元电活动的变化。
1 材料与方法
1.1 pd大鼠模型的建立 选用西安交通大学医学院实验动物中心提供的健康雄性sd大鼠16只，体重180-220g。大鼠在标准环境饲养1周，随机分为对照组(n=6)和pd组(n=10)。pd组大鼠在水合氯醛(300mg/kg, i.p.)麻醉下固定于脑立体定位仪上(narishige)，根据paxinoswatson大鼠脑定位图谱确定右侧黑质致密部的位置：ap 5.0-5.3mm， l 1.9-2.1mm，d 7.2-7.4mm[5]。注射6ohda前30min，先给大鼠注射地西帕明(25mg/kg, i.p., sigma)以保护去甲肾上腺素能神经元。6ohda(sigma)溶于含0.1g/l抗坏血酸的生理盐水中，用前配制。10μl微量注射器与玻璃微电极相连，尖端直径约50μm，分两个位点在黑质致密部注射6ohda，每点4μg/2μl，总量8μg/4μl，给药速度1μl/min，注射完毕后留针5-10min，退针。6ohda注射后1周，大鼠皮下注射阿朴吗啡(0.05mg/kg)，10min后诱发向健侧旋转每5min大于20转者，表明pd模型成功，列为实验对象[6]。
1.2 电生理记录 电生理记录在黑质致密部损毁后2周进行。大鼠在乌拉坦(1.2g/kg, i.p.)麻醉下固定于脑立体定位仪上，并确定右侧trn的位置：ap 1.4-1.6mm；l 1.8-2.0mm；d 5.6-6.2mm[5]。采用玻璃微电极细胞外记录法记录trn内gaba能神经元的放电。电极尖端直径1-2μm，阻抗10-20mω，充灌液为0.5mol/l醋酸钠含20g/l滂胺天蓝。细胞放电经微电极放大器显示于记忆示波器上(nihon kohden)，以观察电位波形和细胞放电的形式，同时信号输入监听器监听。将信噪比大于3∶1的、稳定的单细胞放电经生物电信号采集与分析系统(ced1401 spike2)输入计算机后，做实时观察、储存和进行频率及放电形式的分析，每一神经元的采样时间5-10min。整个实验过程中监测大鼠心电，直肠温度维持在(37±0.5)℃。
1.3 gaba能神经元的确认及放电形式分析 trn的gaba能神经元动作电位是以正相波为主的2相波，动作电位时程1.5-2.5ms，放电频率5-40hz，不规则或短串爆发式活动[1]。根据放电间隔图(interspike interval histogram, isih)和不对称指数确定神经元的放电形式。每一神经元isih的生成最少包含500个动作电位，bin宽4ms。依据该图将神经元的放电形式分为：规则、不规则和爆发式放电。规则放电isih呈对称分布；不规则放电isih呈随机分布；爆发式放电isih呈现逐渐衰减的正偏态分布。从isih中我们还测量和计算了众数(mode)和不对称指数(asymmetry index)，以协助判断神经元放电形式的变化。众数是指最高频率的放电间隔；不对称指数为众数与平均放电间隔的比值，反映放电间隔图的形状，该值小于1表示正偏态分布，反映神经元活动的规律性[7]。
1.4 组织学定位 电生理记录完毕后，通过玻璃微电极电泳滂胺天蓝标记记录位点(-20μa，15min)。大鼠在麻醉下经心脏灌注生理盐水，随后用40g/l多聚甲醛溶液灌注固定，迅速断头取脑，后固定4h。冠状冰冻切片，片厚50μm，确定被记录神经元的位置。
1.5 统计学处理 对符合gaba能神经元特点，且位于trn内的神经元进行统计分析。统计分析采用spss11.0软件，实验数据以均值±标准差(±s)表示。两组大鼠trn内gaba能神经元放电频率的比较采用独立样本t检验，平均放电间隔和不对呈指数采用mannwhitney u检验；2组大鼠放电形式的比较采用χ2检验，以p<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组大鼠trn内神经元的放电频率 实验共记录和分析了52个神经元的电活动，其中pd组29个，对照组23个。这些神经元均符合gaba能神经元的鉴定标准，且位于trn内。对照组大鼠trn内gaba能神经元的放电频率为5.0-35.7hz(14.7±1.6, n=23)，pd组神经元的放电频率变化范围是11.8-67.0hz(33.8±3.0, n=29)。与对照组相比，pd组神经元的平均放电频率显著增高(p<0.001, 图1a)。
图1 两组大鼠trn神经元放电频率、平均放电间隔和不对呈指数的比较（略）
fig.1 comparisons of the firing rate, mean interspike interval and asymmetry index of trn neurons in control and pd rats
a: firing rate; b: mean interspike interval; c: asymmetry index *p<0.001 vs. control group; pd: parkinsons disease
2.2 两组大鼠trn内神经元的放电形式 对照组大鼠的神经元表现出2种放电形式，不规则放电神经元4个(17%, n=23)，爆发式放电神经元19个(83%, n=23)。在pd组大鼠，有3种形式的神经元放电，规则放电神经元2个(7%, n=29)，不规则放电神经元13个(45%, n=29)，爆发式放电神经元14个(48%, n=29)。经χ2检验，pd组大鼠爆发式放电神经元明显减少(p<0.05)，而不规则放电神经元增加，同时有规则放电神经元的出现(图2)。
图2 对照组和pd组大鼠trn神经元放电形式的分布（略）
fig.2 the distribution of firing patterns of trn neurons in control and pd rats
*p<0.05 vs. the value in control rats; pd: parkinsons disease
反映2组大鼠trn中gaba能神经元放电形式的参数平均放电间隔和不对称指数也有显著差异。对照组和pd组神经元的平均放电间隔分别是(86.2±9.2) ms和(37.6±3.7)ms，pd组大鼠的平均放电间隔明显缩短(p<0.001)，表明放电频率增高；不对称指数在对照组大鼠为0.42±0.07，pd组大鼠是0.76±0.06，pd组显著大于对照组(p<0.001)，其均值更接近于1，说明放isih趋向于正态分布，即爆发式活动减少(图1b、1c)。
3 讨论
我们分别从6只对照组大鼠记录到23个gaba能神经元放电，从10只pd组大鼠记录到29个gaba能神经元的电活动，经组织学确认它们均位于trn内。黑质致密部多巴胺能神经元的变性，导致纹状体中多巴胺水平显著降低，从而引起整个基底神经节环路的功能改变。基底神经节环路由直接和间接2条通路所组成，当纹状体中多巴胺水平降低时，组成直接通路的、表达d1受体的纹状体中等大小棘状投射gaba能神经元传出活动降低，使环路的传出核(黑质网状部和脚内核)抑制性输出增加；而组成间接通路的、表达d2受体的纹状体中等大小棘状投射gaba能神经元传出活动增加，抑制苍白球的活动，导致底丘脑核活动增强，兴奋性谷氨酸能传出增加了传出核的抑制性输出。因此，黑质纹状通路的变性导致基底神经节环路直接通路的抑制性活动减弱，间接通路的兴奋性活动增强，使环路的2个传出核的抑制性传出活动增强，进而抑制丘脑和皮质的活动[3]。
基底神经节环路中的苍白球和黑质网状部均发出抑制性gaba能纤维投射到trn[2]。在pd状态下，苍白球活动降低使trn神经元去抑制，而黑质致密部活动增强抑制trn神经元。我们的实验结果证实黑质致密部多巴胺能神经元的损毁引起trn神经元的放电频率显著增高，除了与上述2个核团的活动有关外，也与皮质trn的兴奋性神经传递增强有关。近年来研究发现黑质纹状体通路的变性引起基底神经节内兴奋性谷氨酸能神经传递的增强，这种变化在pd的病理生理机制中具有重要作用[3]。许多研究已经证实pd模型动物和pd患者的底丘脑核谷氨酸能神经元活动增强，深部脑刺激抑制底丘脑核的活动能改善pd患者的临床症状[3]。离体脑片实验也发现黑质纹状体通路的损毁引起皮质纹状体谷氨酸能突触传递增强，并且皮质纹状体纤维末梢第ⅱ组代谢型谷氨酸受体表达增多[8]。我们以往的研究也证实黑质致密部多巴胺能神经元的损毁引起内侧前额叶皮质锥体神经元放电频率增加。皮质锥体神经元活动的增强导致trn内谷氨酸的释放增多，引起trn内gaba神经元的放电频率增加。在pd模型大鼠发现中脑脚桥核的电活动增强，而中脑脚桥核的胆碱能传出通过直接的抑制作用，以及间接抑制黑质网状部神经元的活动，进而降低了网状部对trn的抑制，这也是pd模型大鼠trn神经元活动增强的一个原因[6]。神经元放电形式的变化取决于神经元的自身活动和外来传入的影响，爆发式放电活动与神经递质的释放相关。黑质致密部多巴胺能神经元的变性导致基底神经节环路的抑制性输出增加，抑制丘脑神经元的活动，而丘脑又有丰富的谷氨酸能纤维投射到trn，来自丘脑的兴奋性传入的减少导致trn神经元爆发式活动降低[9]。此外，中脑脚桥核胆碱能传出的增加抑制trn神经元的活动，减少了神经元的爆发式活动。由于中枢神经系统解剖和功能的复杂性，我们的在体实验结果证实黑质纹状体通路的损毁诱发了trn内gaba能神经元的放电频率显著增加，爆发式放电神经元的数目减少。这些变化可能与皮质–trn兴奋性谷氨酸能传递的增强，以及苍白球trn抑制性gaba能传递的减弱有关。同时黑质纹状体多巴胺的耗竭引起trn活动的改变也为pd静止性震颤的起源和认知功能障碍的研究提供了新线索。
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