【摘要】 目的: 探讨nkg2d配体在不同发育阶段树突状细胞（dc）表面的表达及其对自然杀伤（nk）细胞杀伤活性的影响。方法: 用细胞因子（rh il-4、 rhgm-csf、 tnf-α）体外诱导培养单核细胞来源的未成熟树突状细胞（idc）和成熟树突状细胞（mdc）并鉴定形态和表型, 免疫磁珠法分离纯化nk细胞。流式细胞术（fcm）检测idc和mdc表面nkg2d配体mica/b、 ulbp1-3的表达。用ldh释放法检测nk细胞对idc和mdc的杀伤活性以及抗nkg2d单克隆抗体(mab)阻断nk细胞后的杀伤活性。结果: 培养的idc和mdc具有典型的细胞形态和免疫表型特征。idc表面表达mica、 micb、 ulbp1、 ulbp3, 表达率分别为(32.39±8.30）%、 (17.75±3.40)%、 (26.71±6.48)%、 (38.37±6.89)%; mdc表面表达mica 、 ulbp3, 表达率分别为(7.82±2.67)%、 (8.36±2.42)%, 比idc表面相应配体表达率低（p<0.01）。各效靶比nk细胞对idc的杀伤活性均比对mdc的杀伤活性高, 差异有统计学意义(p<0.01)。抗nkg2d mab阻断nk细胞后对idc杀伤活性比阻断前减弱(p<0.05); 对mdc的杀伤活性与阻断前相比无统计学意义(p>0.05)。结论: nkg2d配体在idc表面表达高, 介导了nk细胞对idc的杀伤, 而对mdc的杀伤无影响, 是nk细胞对idc选择性高杀伤的分子机制之一。wWw.11665.cOm
【关键词】 nkg2d配体 自然杀伤细胞 树突状细胞
expression of nkg2d ligands on dendritic cells at different development stages and its effect on cytotoxicity of nk cells
tu san-fang, guo kun-yuan*, hu liang-shan, mei jia-zhuan, zhou jian, sun ming
department of hematology, zhujiang hospital, southern medical university, guangzhou 510282, china
［abstract］ aim: to investigate the expression of nkg2d ligands on dendritic cells（dc） at different development stages and its effect on cytotoxicity of natural killer（nk） cells. methods: the monocytes were cultured into immature dendritic cells（idc） and mature dendritic cells（mdc） with cytokines. nk cells were obtained from normal peripheral blood by cd56 antibody magnetic isolation.the expression of nkg2d ligands (mica/b, ulbp1-3) was detected by flow cytometry. cytotoxicity of nk cells and the nk cells blocked with anti-nkg2d mabs against idc and mdc was tested using ldh-releasing method. results: idc and mdc were of typical morphology and phenotypes. mica, micb, ulbp1, and ulbp3 were expressed on idc and their expression rate was (32.39±8.30)%, (17.75±3.40)%, (26.71±6.48)%, (38.37±6.89)%, respectively. mica and ulbp3 were expressed on mdc and their expression rate was (7.81±3.33)% and (8.36±2.42)%, respectively, which was lower than that on mdc (p<0.01). at the each e∶t ratio cytotoxicity of nk cells against idc was stronger than that against mdc (p<0.01). cytotoxicity of nk cells blocked with anti-nkg2d mab against idc was decreased compared with that of nk cells unblocked (p<0.05) while cytotoxicity of nk cells blocked with anti-nkg2d mab against mdc showed no decrease compared with that of nk cells unblocked (p>0.05). conclusion: the expression of nkg2d ligands on idc is higher than that on mdc, which plays an important role in the cytotoxic effect of nk cells against idc, but has no effect on that aginst mdc. nkg2d-nkg2d ligands shows one of the moleculer mechanisms that nk cells kill idc selectivly.
［keywords］nkg2d ligand; natural killer cell; dendritic cell
树突状细胞（dc）和自然杀伤（nk）细胞是机体免疫系统最重要的组成部分, 二者之间存在相互作用［1］。ruggeri等［2, 3］研究发现在异基因造血干细胞移植中供者nk细胞可以通过杀伤宿主dc来降低移植物抗宿主病（gvhd）的发生。但nk细胞杀伤dc的作用机制仍未完全明确。nk细胞主要通过表面受配体结合起杀伤作用, 本研究旨在通过检测nkg2d配体在不同发育阶段dc表面的表达水平来探索nkg2d受配体识别途径是否参与介导了nk细胞对不同发育阶段dc的杀伤, 为临床运用nk细胞降低gvhd的发生提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 材料 rpmi1640培养基和胎牛血清购自gibco公司。重组人白细胞介素-4 ( rh il-4)、 重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子( rhgm-csf)和肿瘤坏死因子（tnf-α）均为pep rotech公司产品。抗cd56免疫磁珠抗体、 macs磁柱和macs细胞分选仪均为miltenyi公司产品。杀伤活性检测试剂盒（cytotox96 non-radioactive cytotoxocity assay）为promega公司产品。cd3fitc、 cd16pecd56pe mab为bd公司产品。fitc或pe标记的鼠抗人cd80、 cd86、 hla2dr、 cd83、 cd1a单克隆抗体(mab)及其同型对照均为ebiosience公司产品。鼠抗人nkg2d、 mica、 micb、 ulbp1、 ulbp2、 ulbp3 mab和fitc标记的兔抗鼠igg1购自rnd公司。facscabilur型流式细胞仪为beckman-coulter公司产品。
1.2 方法
1.2.1 人外周血单核细胞来源的idc与mdc体外诱导培养与鉴定 常规分离健康志愿者外周血单个核细胞, 以4×109/l细胞密度接种在6孔板中, 置于37℃、 50 ml/l co2培养箱中贴壁培养4 h后, 去除非贴壁细胞, 加入含20 μg/l rhil-4、 50 μg /l rhgm-csf、 100 ml/l胎牛血清的rpmi1640培养液, 置于培养箱培养, 隔天半量换液, 补充等量细胞因子。第6天补加80 μg /l的tnf-α, 共培养9 d。每天倒置显微镜下观察细胞形态。收集第6天和第9天细胞用25 ml/l戊二醛固定, 漂洗, 脱水, 乙酸异物脂置换, 干燥, 喷金后上机用扫描电子显微镜观察鉴定其形态。同样收集第6天和第9天细胞计数后分管, 分别加cd80pe、 cd86 pe-cy5、 hla-drpe、 cd1afe、 cd83fitc mab 4度标记, 对照管加同型对照igg1, 用流式细胞术（fcm）检测各分子的表达, 不同时间点重复3次。
1.2.2 人外周血来源的nk细胞分离 分离另外3位健康志愿者外周血单个核细胞, 每107个细胞加入80 μl pbs和20 μl抗cd56免疫磁珠抗体, 4℃标记15 min后洗涤, 用500 μl的pbs充分混匀后加入到磁柱中, 在macs细胞分选仪中分离, 推注器将分选的阳性细胞推入无菌试管, 为nk细胞。cd3fitc、 cd16pecd56pe mab标记nk细胞检测nk细胞的纯度。
1.2.3 idc、 mdc表面nkg2d配体的fcm检测 分别收集鉴定后的idc与mdc洗涤计数, 分6管, 每管109/100 ml细胞悬液, 按1 μg/106个细胞密度分别加入mica、 micb、 ulbp1、 ulbp2、 ulbp3 mab, 4度标记30 min后洗涤, 加入fitc标记的山羊抗鼠igg1二抗4度标记30 min, 第6管加等量同型igg1作为阴性对照, 洗涤后以fcm检测mica、 micb、 ulbp1、 ulbp2、 ulbp3的表达量。为避免实验误差, 不同时间点重复3次。
1.2.4 nk细胞对idc与mdc杀伤活性的检测 采用ldh释放法［4］, 收集idc, mdc作为靶细胞, nk细胞为效应细胞, 按照cytotox96 non-radioactive cytotoxocity assay杀伤试剂盒说明书操作, 倍比稀释法按效靶比20∶1、 10∶1、 5∶1铺板, 阻断组先加抗nkg2d mab 10 μg/100 μl常温下孵育15 min, 封闭nk细胞表面nkg2d受体, 再加靶细胞。显色后elx-800酶标仪上测a值。nk细胞杀伤率=(实验孔a值－靶细胞自发释放孔a值－效应细胞自发释放孔a值)/(靶细胞最大释放孔a值－靶细胞自发释放孔a值)×100%
1.2.5 统计学处理 应用spss13.0统计软件进行数据处理, 数据以x±s表示, 采用独立样本t检验, p<0.05者表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 idc和mdc的形态和表型 倒置显微镜下观察第6天细胞大部分半悬浮聚集成簇生长, 胞体增大, 表面可见短小毛刺状突起。第9天细胞大部分悬浮生长, 表面树突结构明显。扫面电镜下观察第6天细胞大小10 μm左右, 表面突起短小, 多见薄沙或云雾状皱褶, 符合idc的形态特征（图1a）; 第9天细胞表面突起更多更长, 呈典型树突状结构, 云雾状皱褶稀疏, 符合mdc的形态特征（图1b）。fcm结果显示第6天dc表面共刺激分子cd80和cd86分别为（40.8±7.9）%和（45.1±3.7）%, hla-dr表达为（59.9±5.2）%, 特异性分子标志物cd1a高表达为（71.9±5.2）%, 成熟分子标志物cd83低表达为（14.9±1.9）%, 为不成熟阶段表型。第9天测得cd80、 cd86和hla-dr表达升高为（71.5±7.3）%、 （79.9±6.7）%和（88.6±6.6）%, cd1a仍高表达, cd83表达升高为(65.5±3.8)%, 为成熟阶段表型。
图1 扫描电镜下观察dc形态（略）
fig 1 the morphologies of dc observed by scanning electron microscope
a: day 6; b: day 9.
2.2 nk细胞的纯度 fcm结果显示外周血单个核细胞经免疫磁珠分选后nk细胞（cd3-cd16+cd56+）的纯度为（91.66±4.04）%, 能满足实验要求（图2）。
图2 免疫磁珠法分选后nk细胞的纯度（略）
fig 2 purification of nk cells after immunomagnetic isolation
2.3 idc和mdc表面nkg2d配体的表达 idc表面表达mica、 micb、 ulbp1和ulbp34个配体; mdc表面只表达mica、 ulbp22个配体, 且比idc表面相应配体表达率低, 差异均有统计学意义（p<0.01）。其他配体表达率均低于5%, 视为阴性结果(表1, 图3)。
表1 nkg2d配体在idc和mdc表面的表达率（略）
tab 1 expression of nkg2d ligands on the surface of idc and mdc
bp<0.01 vs idc.
图3 idc和mdc膜表面nkg2d配体的表达（略）
fig 3 expression of nkg2d ligands on the surface of idc and mdc
2.3 nk细胞对idc与mdc的杀伤活性 各效靶比nk细胞对idc的杀伤活性分别高于对mdc的杀伤活性, 差异均有统计学意义（p<0.01）。nkg2d mab阻断nk细胞后, 各效靶比nk细胞对idc的杀伤活性降低（p<0.05）; 对mdc的杀伤活性与阻断前相比均无统计学意义（p>0.05）; 阻断后的nk细胞对idc的杀伤活性比阻断前nk细胞对mdc的杀伤活性高, 差异有统计学意义（p<0.05, 图4）。
图4抗nkg2d mab阻断前后nk细胞对idc和mdc的杀伤活性（略）
fig 4 cytotoxicity of nk cells and the nk cells blocked with anti-nkg2d mab against idc and mdc
3 讨论
nk细胞和dc是机体天然免疫和获得性免疫系统中重要的组成部分, 近年来研究［1, 5］表明二者在天然免疫早期阶段存在相互作用, dc能增强nk细胞的杀伤活性, 同时nk细胞能选择性杀伤idc, 到目前为止其杀伤机制仍在探索中。dc根据发育阶段的不同可分为idc和mdc, 其在形态, 表型和功能上有所不同［6］。nk细胞的杀伤活性同时受活化性和抑制性受配体结合产生的信号平衡调节起作用［7］, 其活化性受体主要包括ii型跨膜蛋白受体nkg2d和nk细胞自然细胞毒受体ncr, 与配体结合向nk细胞传递活化性信号。nkg2d配体［8］主要包括多态性的mhc-i类链相关的肽a、 b（mica/b）和人巨细胞病毒ul16结合蛋白(ulbps), 它们在不同发育阶段dc的表达情况尚未见研究报道。我们通过fcm分别检测idc和mdc表面nkg2d配体的表达, 结果显示idc表面表达mica、 micb、 ulbp1和ulbp3, 而mdc表面只表达mica和ulbp3, 且表达率很低。因此idc可以通过表面nkg2d配体与nkg2d结合激活nk细胞的杀伤活性, mdc通过nkg2d配体很难激活nk细胞。本研究杀伤试验显示nk细胞对idc的杀伤活性比对mdc的杀伤活性高很多, 与其他研究结果一致［9］。nkg2d mab阻断nk细胞后降低了nk细胞对idc的杀伤活性, 但对mdc的杀伤没有影响。因此可认为nkg2d受配体识别信号途径介导了nk细胞对idc的杀伤, 没有介导对mdc的杀伤, 是nk细胞选择性高杀伤idc的机制之一。
nk细胞的杀伤作用除了受活化性信号作用之外, 同时受抑制性信号的共同调节作用。nk细胞抑制性信号受体主要包括杀伤细胞免疫球蛋白样受体kir和cd94/nkg2a等, 分别与靶细胞表面的hla-ⅰ类分子和不典型的i类分子结合, 向nk细胞传递抑制性信号［10］。本研究结果显示抗nkg2d mab阻断后对idc的杀伤活性仍比未阻断前nk对mdc的杀伤活性高, 说明抗nkg2d mab不能完全阻断nk细胞对idc的杀伤, 同时其他受配体识别途径介导。除了其他活化性信号途径外, 更主要的就是抑制性信号在二者强弱不等。ferlazzo等［11］发现mdc高表达抑制性配体mhc-i类分子, 而idc低表达, 这可能也是idc被nk细胞选择性杀伤的原因之一。
在异基因造血干细胞移植中利用nk细胞对idc 的杀伤清除能力, 输入kir/hla错配的nk细胞可能做为一种安全有效的过继细胞免疫治疗方法用于白血病的治疗, 降低gvhd的发生。本研究发现nkg2d配体在idc表面表达, 并首次证实它直接影响nk细胞对idc的选择性杀伤, 为临床造血干细胞移植合理选择供者提供了一定的理论依据。
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