【摘要】 目的：检测幽门螺杆菌标准菌株nctc11637及临床分离菌株hp1和hp2的oipa基因，分析其核苷酸序列，比对其与国际标准菌株hp 26695的同源性。方法：常规方法培养幽门螺杆菌，提取dna，pcr法扩增oipa基因，检测其核苷酸序列，并比较其与hp 26695的同源性。结果：nctc11637及hp1、hp2均表达oipa基因。其核苷酸序列与hp 26695比对，nctc11637有48个突变位点、hp1有48个突变位点、hp2有50个突变位点，同源性均为94%。nctc11637与hp1的同源性为100%、与hp2的同源性为97%。结论：nctc11637、hp1、hp2均表达oipa基因，但不同菌株oipa基因的核苷酸序列有所不同。
【关键词】 幽门螺杆菌 oipa基因 序列比对
detecting of gene oipa of normal and clinical helicobacter pylor strains and comparing of their nucleotide sequences
shao shihe, wang hua, liu muqing, han xiaohong, duan xiujie.
medical technology college, jiangsu university, zhenjiang 212001,china
［abstract］ objective:to detect the oipa gene of helicobacter pylori(hp) strains nctc11637 and hp1, hp2 isolated from clinical biopsies, analyze their nucleotide sequences and make a homologous comparison of nucleotide with hp 26695.methods:the oipa gene was detected with pcr in helicobacter pylori(hp) strains nctc11637 and hp1, hp2 isolated from clinical gastric biopsies after routine culture. then pcr products were sent out for nucleotide sequence analysis and compared with hp 26695.results:the sequence of the aim gene was obtained in nctc11637 and hp1, hp2 and was made a homologous comparison of nucleotide with 26695. the number of mutation of nctc11637, hp1 and hp2 and was 48,48,50 respectively. the identity was 94%, 94% and 94% respectively, while the strain hp1 was most identical to 11637 as much as 100%. the homology of hp2 and 11637 was 97%.conclusion:hp1, hp2 and nctc11637 expresse gene oipa, but the sequences of gene oipa of different strains are distinct.
［key words］ helicobacter pylori；oipa gene；outer membrane protein
前炎症蛋白（outer inflammatory protein，oipa）为幽门螺杆菌(helicobacter pylori，hp)外膜蛋白的一种。WWW.11665.COm本文通过pcr方法扩增了nctc11637及两种临床分离菌株的oipa基因片段，并对其核苷酸序列进行了比对分析，以探讨oipa基因在不同菌株中的表达和序列状况，为进一步研究幽门螺杆菌的致病性及其致病机制提供依据。
1 材料与方法
1.1 菌种 nctc11637购自中国预防科学院流行病学研究所；临床菌株hp1从胃溃疡患者胃黏膜活检组织分离获得、hp2从十二指肠溃疡患者胃黏膜活检组织分离获得。
1.2 主要试剂和仪器 厌氧袋购自oxoid公司；taq酶、dntp购自takara公司；pcr基因扩增仪（mastercycler gracent, eppendor公司）；自动凝胶成像系统（美国uvp公司）。
1.3 hp培养与鉴定 nctc11637按常规方法培养。临床菌株分离培养：将尿素酶试验阳性的胃溃疡和十二指肠溃疡患者的胃黏膜活检组织直接涂布于哥伦比亚培养基上，置37℃微需氧培养，96小时后挑取可疑菌落进行革兰染色及生化反应鉴定。
1.4 hp dna提取 刮取培养96小时的菌落，按以下步骤提取dna。用1 ml pbs收集细菌，并悬浮细胞；13 000 r/min离心5分钟，去掉上清；100 μl te悬浮细胞，加500 μl ges混匀，13 000 r/min离心5分钟；将上清移到洁净管中，加入650 μl氯仿混匀，离心5分钟；将上清移到洁净管中，加入0.54×的异丙醇，混匀，室温5分钟；离心1分钟，弃上清液，用500 μl 70%乙醇洗涤；自然干燥后用100 μl te重悬，贮藏于4℃冰箱过夜。
1.5 引物合成与pcr扩增 根据genbank中hp 26695的oipa基因序列，由上海博亚公司设计并合成引物，其序列为p1：5′ggatccatgaaaaaagctctcttact3′，p2：5′ctcgagttaatgtttgtttttaaagtt3′。用50 μl反应体系进行pcr扩增。其参数为：94℃预变性4分钟后，按94℃ 2分钟、51.7℃ 2分钟、72℃ 55秒，40个循环，最后延伸7分钟。pcr产物经1.4%琼脂糖凝胶电泳分析鉴定。
1.6 oipa基因的核苷酸序列测定并比对 将takapa公司测定的核苷酸序列通过genbank与hp 26695的oipa基因的核苷酸序列进行比对。
2 结果
2.1 hp分离培养与鉴定 培养96小时的nctc11637、hp1和hp2革兰染色后，镜下可见海鸥状、弧形、s形的革兰阴性菌，并且尿素酶、氧化酶、触酶试验均阳性。
2.2 pcr扩增产物琼脂糖凝胶电泳 1.4%琼脂糖凝胶电泳结果显示nctc11637、hp1和hp2的pcr扩增产物均存在oipa基因条带，见图1。
2.3 nctc11637、hp1和hp2的oipa基因的核苷酸序列与hp 26695的同源性比对 测序结果与hp 26695比对：nctc11637有48个突变位点、hp1有48个突变位点、hp2有50个突变位点，同源性均为94%。在169位点nctc11637、hp1、hp2分别有一段插入序列，为6个碱基。nctc11637与hp1同源性为100%，与hp2同源性为97%。
图1 pcr产物琼脂糖凝胶电泳（略）
fig.1 agarose gel electrophoresis analysis of pcr product
note:1.dna marker;2.nctc11637;3.hp1;4.hp2.
3 讨论
oipa是一种编码相对分子量为34 kd的幽门螺杆菌外膜蛋白基因，又称hoph，基因位置hp0638，编码产物称前炎症蛋白oipa。早在1998年，yamaoka等［1］就发现前炎症蛋白与il8的水平呈正相关。2000年，yamaoka又发现hp0638突变株诱导il8的量明显减少，可达50%，因此将hp0638基因命名为oipa［2］。还有学者发现hp0638的状态与caga、vaca、icea的基因型密切相关［3］。yamaoka等［4］还发现oipa的状态是唯一能够将十二指肠溃疡从胃炎中区分出来的指标，功能性的oipa与hp的密度、中性粒细胞浸润的严重程度以及胃黏膜il8水平密切相关。陈道荣等［5］对oipa基因进行了克隆和序列分析。
本文通过pcr法扩增了标准菌株nctc11637和两株临床分离菌株的oipa基因片段，测定了其序列，并比较了其与国际标准菌株hp 26695的同源性。结果显示：nctc11637有48个突变位点、hp1有48个突变位点、hp2有50个突变位点，同源性均为94%；在169位点nctc11637、hp1、hp2分别有一段插入序列，为6个碱基。nctc11637与hp1同源性为100%，与hp2同源性为97%。上述结果说明nctc11637、hp1、hp2均表达oipa基因，但不同菌株的oipa基因的序列有所不同。这些突变点是否引起氨基酸变化，是否对其抗原性有影响还有待进一步研究。
【参考文献】
1 yamaoka y, kodama t, graham d y et al. search for putative virulence factors of helicobacter pylori, the lowmolecularweight(3335k) antigen ［j］. dig dis sci, 1998;43:14821487.
2 yamaoka y, kwon d h, graham d y. a mr 34 000 proinflammatory outer membrane protein(oipa) of helicobacter pylori ［j］. proc natl acad sci usa, 2000; 97: 75337538.
3 ando t, peek r m, pride d et al. polymorphisms of helicobacter pylori hp0638 reflect geographic origin and correlate with caga status ［j］. j clin microbiol, 2002;40: 239246.
4 yamaoka y, kikuchi s, elzimaity h m et al. importance of helicobacte pylori oipa in clinical presentation, gastric inflammation, and mucosal interleukin 8 production ［j］. gastroenterology,2002;123: 414424.
5 陈道荣，黄爱龙，陶小红 et al. 幽门螺杆菌前炎症蛋白oipa的基因克隆与序列分析 ［j］. 四川医学，2003;24（8）：793795.
