作者：裴广柱 施书东 马振莲
【摘要】 目的：研究制定生肌膏的质量标准。方法：择生肌膏的制备工艺、药味或有效成分鉴别和有效成分含量测定三大项目进行研究。制备工艺研究重点是对生地、当归、生龟板的提取，改高温油炸法为水煎提取法，相应调整其他工艺环节;药味或有效成分鉴别采用薄层色谱法、理化法和显微鉴别法;有效成分含量测定采用高效液相色谱法。结果：制备工艺研究成功，取得了一系列重要技术参数，新工艺制品疗效提高36%;成品制剂中全部方药均实施了鉴别检测;生地、当归、炉甘石三味成功进行了主要有效成分含量测定。结论：该研究为制定新的质量标准奠定了坚实基础。
【关键词】 生肌膏; 质量标准; 制备工艺; 方药鉴别; 含量测定
生肌膏方药由珍珠、龟板、生地、当归、生石膏和炉甘石等组成，功效滋阴解毒，生肌敛疮，促进上皮愈合，主治疮疡不愈、烧伤烫伤等。长期临床实践证明，在中西药同类制剂中，生肌膏独具特别显著的治疗效果。但由于受到医药科技发展的限制，其质量标准工作一度停滞不前。为了科学地继承发扬中医药精华，依据当前科技发展新形势，我院药学工作者对生肌膏质量标准的建立进行了研究。WWW.11665.COm现从制备工艺、成分鉴别和含量测定三个重要方面阐述。
1 制备工艺
1.1 工艺过程
1.1.1 取麻油2000g置加热锅内加热至260℃，加入生血余，维持油温260℃～300℃，30min，至血余完全炭化，捞出血余炭，置乳钵内加少量油液研成细糊状，备用;油液另置，备用。
1.1.2 取麻油1000g，加热至100℃，加入当归炸提20min;油温升至130℃，续炸5min，至当归饮片微焦而尚未炭化时捞出，油液过滤备用。
1.1.3 将过油当归残渣合并生地，水煎法提取2次，每次45min，煎液过滤，浓缩成稠膏备用。另将生龟板碎成0.5×0.5cm2粗粒，水煎法提取6～8次，每次60min，以手拈龟板即酥为度，煎液过滤，浓缩成稠膏备用。
1.1.4 将5000g新油兑入炸过血余炭的油液中，维持油温220℃，投入生石膏粉和生炉甘石粉熬炼30min;另取蜂蜡熔化过滤后兑入油液中续炼10min，降温，维持油温80℃，备用。
1.1.5 将1.1.2油液与1.1.4油液混合为a;将1.1.3两组稠膏混匀后加适量无水羊毛脂研和均匀为b;按等量递加法将a与b研和均匀，维持温度50℃，为c;取适量c膏与珍珠粉、血余炭糊研和均匀，剩余c膏分次等量兑研，成为终膏d即可。
1.2 制备工艺研究
1.2.1 油炸血余 油炸血余意在制炭。在1个大气压和25℃±5室温条件下，油温低于260℃，血余不发生炭化反应;油温达260℃开始出现炭化反应，但反应不完全;只有经过一段时间热的蓄积和转换，生血余才能渐次炭化，达300℃时才会呈现较完全的炭化反应，此时血余炭呈蜂窝状固态，用金属软膏刀击之有声，说明恰到好处。油温超过300℃，血余炭受热液化，逐渐产生无焰燃烧和油、炭有焰燃烧。油温300℃超过30min，血余炭无明显变化，但无制剂意义。
1.2.2 油炸当归 油炸当归，目的是溶提挥发油。用100℃麻油炸提当归，沸点低于100℃的挥发油均可大部溶出，但饮片表面不变色，说明100℃油温对当归饮片的脱水能力尚不明显。油温超过100℃，较高沸点的挥发油开始溶出，这时当归断面由黄白色逐渐变成暗黄色，证明当归开始脱水。但如果油温超过130℃或130℃超过5min，则当归迅速炭化。当归一旦炭化，就失去了之后的水提价值。因此，油炸当归必须特别强调控制火候，兼顾溶提挥发油和之后的水提水溶性成分。
1.2.3 水提生地当归 生地主含梓醇及大量多糖，当归主含除上述挥发油，尚含阿魏酸及多糖。两组有效成分均系亲水疏油物质。老工艺经260℃高温油炸，药油又经60min熬煎，使以上成分损失几乎达到100%，成品制剂中有关成分鉴别均呈阴性反应。新标准采用水提法，从根本上改变了这种状况，成品制剂中有关成分鉴别均呈阳性反应，有关成分的含量均与中药饮片剂量呈平行关系，使成品中有关成分的含量测定成为可能。
1.2.4 水提生龟板 生龟板的主要成分为氨基酸，亦是亲水疏油物质。老工艺亦经260℃高温油炸，药油又经60min熬煎，造成100%损失。新标准根据相似相溶规律，改油炸法为水提法，使成品中氨基酸的鉴别和含量测定成为可能。水提生龟板，必须注意，要以生龟板入煎，不可以砂烫品入煎。砂烫品固然容易煎出有效成分，但从中医理论观，生龟板擅长滋阴潜阳，而砂烫龟板滋阴潜阳功效降低。为了最大限度把生龟板中的氨基酸提出来，除适当增加提取次数和提取溶剂之外，应将生龟板碎成小块或粗粒，增大与水溶剂的接触面积。通过比较计算可知，一块12×18×0.2cm3的生龟板，如果碎成0.5×0.5×0.2cm3小块，表面积将会增大863倍，提取效率相应大幅提高。生龟板中氨基酸提尽的“度”就是把生龟板煮“酥”，手拈龟板，一拈即碎。
1.2.5 控温缩时 控温是指控制大组分油性基质的熬炼温度;缩时是指适当减少熬油时间。本标准中，除油炸血余炭过程，使25%的基质麻油达到300℃外，其余75%的基质麻油升温均控制在220℃以内，大组分油液熬炼时间也从过去的60min缩减为40min。如此控温缩时，可大幅度减少麻油在高温长时间条件下大量的分解、氧化、聚合反应，大幅度减少低分子醛、酮的生成，从而在最大程度上避免火毒的产生。生肌膏是外用中药软膏，没必要象制黑膏药那样，使麻油高度分解高度聚合，相反，麻油药液熬的“嫩”一点，却能使生肌膏疗效明显提高，用于早、中、后三期外科疮疡诸证，均为适宜。
1.2.6 混合兑膏 用水提法收集到了生地、当归和生龟板的稠膏，随即面临如何将水提稠膏与大组分油性基质混合的问题。实践证明，必须解决三方面问题：第一是选择合适的w/o型乳化剂，将水提稠膏乳化切割，然后与大组分油性基质混合;第二是选择恰当的温度70℃～80℃，使乳化切割成功;第三是研磨作功。三者缺一不可，但以第一个条件最为重要。曾做过多次实验，用单硬脂酸甘油酯乳化的水提稠膏，同样在70℃条件下，研磨作功量，超过用无水羊毛脂乳化水提稠膏研磨作功量的100%还多。因此，选定用无水羊毛脂作w/o型乳化剂。
2 成分鉴别
成分鉴别方法，包括理化法，薄层色谱法和粉末显微法。各种方法所用的试剂、仪器、材料，供试品均由本院药厂提供，所用对照品由山东省药品检验所提供。
2.1 炉甘石
2.1.1 碳酸盐 取生肌膏1.0g，加乙醚10ml溶洗2次，弃去醚液，收集残渣，加50%乙醇10ml荡洗2次，弃去乙醇液，残渣加10ml稀盐酸，即出现泡沸，发生二氧化碳气，导入氢氧化钙试液中，即生成白色沉淀。
2.1.2 锌盐 取以上炉甘石的稀盐酸溶液，加亚铁氰化钾试液，即生成白色沉淀;分离，沉淀在稀盐酸中不溶解。
2.2 生石膏
2.2.1 钙盐 取生肌膏1.0g，加乙醚10ml溶洗2次，弃去乙醚液，残渣加50%乙醇10ml荡洗2次，弃去乙醇液，残渣加10ml稀盐酸溶解，过滤，滤液作为供试品溶液。取铂丝用盐酸湿润后蘸取供试品，在无色火焰中燃烧，火焰即显砖红色。
2.2.2 硫酸盐 取供试品溶液，滴加氯化钡试液，即生成白色沉淀;分离，沉淀在盐酸或硝酸中均不溶;另取供试品溶液，滴加醋酸铅试液，即生成白色沉淀，分离，沉淀在醋酸铵试液或氢氧化钠试液中溶解。
2.3 珍珠(粉末)
取生肌膏1.0g，加乙醚10ml溶洗2次，弃去乙醚液，残渣加50%乙醇10ml荡洗2次，弃去乙醇液，收集残渣，干燥、研粉，置显微镜下观察：(散在状态)不规则碎块，半透明，具彩虹样光泽。表面颗粒性由数至十数薄层重叠，片层结构排列紧密，可见致密的成层线条或极致密的微波状纹理。置紫外光灯(365mm)下观察，显浅蓝色或亮黄色，以环周部分较明亮。
2.4 龟板(氨基酸)
取生肌膏1.0g，加乙醚10ml溶洗2次，静止，弃去乙醚液，残渣加乙醇10ml荡洗，静止，弃去乙醇液，残渣加水10ml溶解，水溶液过滤，浓缩至5ml作为供试品溶液。取供试品溶液，加茚三酮试液0.5ml，水浴加热15min，溶液显蓝紫色。另取供试液1ml，加新制的1%硫酸铜溶液和40%氢氧化钠溶液(1:1)混合液数滴，振摇，溶液显紫红色。
2.5 地黄(梓醇)
取生肌膏1.0g，加乙醚10ml溶洗2次，静止，弃去乙醚液，残渣加甲醇10ml溶解，浓缩至5ml，放冷，滤过，作为供试品溶液。另取梓醇对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液。照薄层色谱法试验，取以上两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以氯仿甲醇水(14:6:1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以茴香醛试液，在 105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
2.6 当归(阿魏酸)
取生肌膏1.0g，加乙醚10ml溶提2次，静止，收集乙醚液，挥去乙醚，残渣加甲醇10ml溶解，滤过，浓缩成1ml作为供试品溶液。另取阿魏酸对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以苯乙酸乙醋甲酸(4:1:0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
3 含量测定
含量测定方法包括理化法和高效液相色谱法，所用试剂、仪器、材料及供试品均由本院药厂提供。对照品由山东省药品检验所提供。
3.1 炉甘石(氧化锌)
精密称定生肌膏1.000g，加乙醚10ml溶洗3次，乙醚液弃去;残渣加甲醇10ml洗2次，甲醇液弃去;残渣加水10ml洗2次，水溶液弃去。收集残渣，置锥形瓶中，加稀盐酸10ml，摇匀使溶解，加浓氨试液与氨一氯化铵缓冲液(ph10.0)各10ml，摇匀，加磷酸氢二钠试液10ml，振摇，滤过。锥形瓶与残渣用氨一氯化铵缓冲液(ph10.0)1份与水4份的混合液洗3次，每次10ml，合并洗液与滤液，加30%三乙醇胺溶液15ml与铬黑t指示剂少量，用乙二胺四醋酸二钠滴定液(0.05mol/l)滴定至溶液由紫红色变为纯蓝色。每1ml乙二胺四醋酸二钠滴定液(0.05mol/l)相当于4.069mg的氧化锌。药典规定[1]，炉甘石含氧化锌不得少于40%。生肌膏中，含炉甘石6.15%，即每1g生肌膏含炉甘石按氧化锌计算不得少于2.46mg。按以上方法检测5批成品制剂，结果见表1。
3.2 地黄(梓醇)
3.2.1 色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以乙腈0.1%磷酸溶液(1:99)为流动相;检测波长210nm。理论板数按梓醇峰计算不低于5000，分离度大于1.5。
3.2.2 对照品溶液的制备与线性关系考察 精密称取梓醇对照品适量，加流动相制成每1ml含5mg的溶液。精密量取对照品溶液0.1ml，0.2ml，0.4ml，0.6ml，0.9ml，分别加流动相定容至5ml，各进样10μl，峰面积分别为3221，6466，13005，19293，28892。设峰面积为y，进样量(或进样浓度)为x，以峰面积对进样量回归，得方程y=3206.3139x+67.6846，r=0.9999，说明在进样量1μg～9μg范围内，峰面积与进样量(或进样浓度)之间呈现良好的线性关系。
3.2.3 供试品溶液的制备 精密称定生肌膏1.000g，加乙醚10ml溶洗3次，弃去乙醚液;残渣加甲醇10ml溶解，过滤，滤液浓缩至干;残渣加流动相溶解，转移至10ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。药典[1]规定，生地黄按干燥品计算，含梓醇(c15h22o10)不得少于0.20%，生肌膏中含生地黄3.07%，即每1g生肌膏含梓醇不得少于61.0μg。
3.2.4 精密度试验 精密吸取对照品溶液0.5ml，加流动相定容至5ml，进样10μl，测定峰面积，连测5次，rsd=2.16%。
3.2.5 稳定性试验 精密吸取同一批号供试品溶液10μl，进样测定峰面积，连测5次，间隔时间分别为2h、4h、8h、12h、24h，rsd=3.18% 。
3.2.6 重复性试验 精密吸取5个不同批号的供试品溶液各10μl，平行进样，测定峰面积，rsd=3.22% 。
3.2.7 加样回收率试验 取已知生地梓醇含量的同一批号的生肌膏5份，每份1g，按3.2.3项制成供试品溶深，分别精密加入对照品适量，各精密吸取20μl，进样测定峰面积，平均回收率为98.22%，rsd=1.8% 。
3.2.8 样品测定结果 分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，进样测定峰面积，按外标法计算含量，结果见表1。
3.3 当归(阿魏酸)
3.3.1 色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以乙腈0.085%磷酸溶液(17:83)为流动相;检测流长316mm;柱温35℃，理论板数按阿魏酸计算不应低于5000，分离度大于1.5。
3.3.2 对照品溶液的制备与线性关系考察 精密称取阿魏酸对照品25mg，加甲醇制成每1ml含5mg的对照溶液。分别精密量取对照品溶液0.1ml，0.2ml，0.4ml，0.6ml，0.9ml，1.0ml，1.2ml，置5ml棕色量瓶中，加甲醇定容，各精密吸取10μl进样，峰面积分别为39186，78392，156789，235269，352978，392164，470598。设峰面积为a，进样量(或浓度)为c，以峰面积对进样量回归，得方程a=39221.3698c-50.4275，r=0.9999，在进样量1.0μg～12.0μg范围内，峰面积与进样量(或浓度)呈现良好的线性关系。
3.3.3 供试品溶液的制备与测定方法 精密称定生肌膏1.000g，加乙醚10ml溶提3次，收集乙醚液，挥去乙醚，残渣用70%甲醇10ml溶提2次，合并甲醇溶液，过滤，浓缩至0.8ml，作为供试品溶液。分别精密吸取每1ml含阿魏酸10μg的对照品溶液与供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，测定，即得。
药典[1]规定，当归含阿魏酸(c10h10o4)不得少于0.050%，生肌膏中含当归1.56%，即每1g生肌膏含阿魏酸不得少于7.8μg。按以上方法检测5批成品制剂，结果见表1。表1 生肌膏重要有效成分含量测定结果
4 讨论
生肌膏的制备工艺标准，融入了一定的现代科技成分，较之当初传统的高温油炸法，有很大进步，临床疗效的显著提高，验证了新工艺标准的科学性和合理性。但在整体组方和整体工艺方面，尚待继续研究。同时，生肌膏主要有效成分的鉴别和含量测定也需进一步探讨。比如方药珍珠，是生肌敛疮要药，应设含量测定项目。但要测定珍珠的主成分碳酸钙，在三种药物混杂情况下，存在一定干扰。因为如果测钙，石膏中也含钙;如果测碳酸根，炉甘石中也含碳酸根，所以测钙测碳酸根都不能解决珍珠中碳酸钙的含量测定问题。这就迫使我们另选思路，设计一个公式，珍珠中含钙摩尔数=混合物含钙总摩尔数-石膏中硫酸根摩尔数，或者珍珠中碳酸根摩尔数=混合物碳酸根总摩尔数-炉甘石中含锌摩尔数。这种设计当否，有待实验回答。
【参考文献】
1 中华人民共和国药典(一部)，北京：化学工业出版社，2005，82;89;157.
