阿司匹林与黄芪颗粒合用对大鼠alzheimer’s模型炎症因子影响研究
【关键词】 阿司匹林；黄芪颗粒；阿尔茨海默病；炎症因子
【摘要】 目的：探讨不同剂量阿司匹林与黄芪颗粒合用后对阿尔茨海默病大鼠模型的炎症因子影响。方法：60只sd大鼠随机分为空白、假手术、模型、黄芪颗粒+阿司匹林（3，10，30mg.kg-1），将β淀粉样蛋白(aβ1-40)10μg(1μl)注入大鼠双侧海马ca1区制ad模型，给药组造模前2小时灌服阿司匹林3，10，30mg.kg-1+黄芪颗粒3g.kg-1，其余组给予等量双蒸水，之后连续灌服2周，每天一次，第3周通过morris水迷宫和穿梭箱实验观察大鼠记忆能力改变；之后处死大鼠，elisa法检测海马组织il6和tnfα水平变化。结果：同假手术组相比，模型组寻找平台时间潜伏期明显延长，末次跨平台次数较少，il6和tnfα明显升高，有统计学意义（p＜0.05）。同模型组相比，阿司匹林3，10，30mg.kg-1+黄芪颗粒3 g.kg-1三组寻找平台时间潜伏期明显缩短，末次跨平台次数增加，海马组织il6和tnfα水平降低，有统计学意义（p＜0.05）。结论：阿司匹林与黄芪颗粒合用能够抑制aβ1-40所致大鼠阿尔茨海默病模型海马区il6和tnfα的释放，提示其改善学习记忆能力可能与抑制炎症因子释放有关。
【关键词】 阿司匹林；黄芪颗粒；阿尔茨海默病；炎症因子
阿尔茨海默病（alzheimer’s disease,ad）是一种以进行性认知功能障碍和记忆损害为特征的神经退行性疾病［1］，其发病机制复杂，炎症学说越来越得到重视，研究认为ad的神经慢性退行性变可能是脑内免疫和炎症反应不适当激活的结果。wWW.11665.COm随后大量实验证据也证实ad患者大脑中存在着明显的非特异性免疫的炎症反应，而且在斑块形成的早中期即起作用［2，3］。流行病学研究显示，非甾体抗炎药物(nsaid)和甾体抗炎药物的治疗可使ad的危险性减低50％［4］。本实验首次选择非甾体抗炎药物阿司匹林(aspirin,apc)与黄芪颗粒(huangqi grain,hqg)合用，观察对大鼠ad模型的作用以及相关炎症因子的影响，从抗炎角度探讨阿尔茨海默病的治疗并分析其相关因素。
1 材料与方法
1.1 药品与试剂阿司匹林（重庆天圣制药有限公司，国药准字h50021321）；黄芪颗粒（贵州汉方息烽药业，国药准字z19993254）；aβ1-40(北京博奥森生物技术有限公司，2008331723 7)；il6,tnfα酶联免疫试剂盒（cayman化学公司）。
1.2 动物清洁级sd大鼠60只，雌雄各半，12月龄，体重350-450g（泸州医学院动物实验中心提供，动物准字号：川医动字2400115）。
1.3 仪器大鼠脑立体定向仪(zh蓝星b脑立体定位仪,淮北正华生物仪器设备有限公司)；mt200大鼠morris水迷宫视频跟踪分析系统（成都泰盟科技有限公司）；大鼠穿梭箱（医学科学院药研所）；微量注射器（上海保西玻璃仪器厂）550型酶标仪（biorad,美国）。
1.4 方法
1.4.1 阿尔茨海默病模型的建立 模型组、模型+阿司匹林3，10，30 mg.kg-1+黄芪颗粒3 g.kg-1组大鼠用3%戊巴比妥钠（30 mg.kg-1）麻醉后，固定于脑立体定位仪上，头顶部正中切口，暴露前囟。参照大鼠脑立体定向仪图谱［5］（ap：3.5mm,ml2.0mm,h:2.7mm）处为穿刺点，钻开颅骨，将aβ1-401μl（10μg）缓慢注入到海马ca1区，假手术组给予等量无菌双蒸水，注入时间5分钟，留针时间5分钟。局部消毒后缝合皮肤。
1.4.2 分组与给药 60只sd大鼠随机分为空白，假手术，模型，模型+阿司匹林3，10，30 mg.kg-1+黄芪颗粒3 g.kg-1 6组，每组10只。给药组于造模前2小时第一次灌胃给药（10ml.kg-1，ig），空白，假手术和模型组给等体积双蒸水。每天上午给药1次，连续4周。
1.4.3大鼠空间学习记忆能力检测［6］ 各组大鼠于术后第3周进行morris水迷宫检测，具体方法见参考文献［6］。（1）定位航行实验：第一天大鼠自由游泳2分钟，第二天起分上下午两段，每段训练4次，连续4d，记录大鼠寻找并爬上平台所需时间(逃避潜伏期)；（2）空间搜索实验：第5天撤除平台，记录2 min内大鼠跨过平台相应位置的次数。
1.4.4大鼠条件性学习记忆能力检测［6］ 各组大鼠于术后第3周进行穿梭箱检测，具体方法见参考文献［6］。实验前设计循环次数为20次，间隔时间为5秒，蜂鸣时间为5秒，电击时间为10秒，电压50伏。实验共5天，每天1次。前4天为训练期，第5天正式实验，记录：（1）遭受电击次数，该值与设定循环次数之差即为主动回避次数(active avoidance response times,aart)。（2）遭受刺激时间即为被动回避潜伏期(eacape response latency,erl)。（3）主动回避反应时间：即主动回避潜伏期(active avoidance response latency,aarl)。
1.4.5elisa法检测il6,tnfα 完成空间学习记忆和条件学习记忆实验后断头处死大鼠，冰上迅速取出海马，右侧海马用作il6，tnfα检测，准确称取50mg匀浆，4℃，1500g×10min。严格按照elisa试剂盒说明书操作，在酶标仪a450 nm读取il6,tnfα光密度值，余保留于-80℃冰箱备用。
1.5统计学方法 实验数据以x±s表示，数据分析组内比较采用单因素方差分析，组间比较采用snk法。p＜0.05表示有统计学差异。统计学数据用spss12.0软件分析处理。
2 结果
2.1 对大鼠空间学习记忆能力影响 与假手术组比较，模型组大鼠平均潜伏期明显延长（p＜0.01），提示模型成功。与模型组比较，模型+阿司匹林10，30 mg.kg-1+黄芪颗粒3 g.kg-1组大鼠平均潜伏期缩短，有统计学意义（p＜0.05），模型+阿司匹林3 mg.kg-1+黄芪颗粒3 g.kg-1 组无统计学意义（p＞0.05），见表1。
2.2对条件性学习记忆能力影响 与假手术组比较，模型组主动回避次数明显减少，主动回避潜伏期明显延长，被动潜伏期也明显延长（p＜0.01），提示模型成功。与模型组比较，模型+阿司匹林3，10，30 mg.kg-1+黄芪颗粒3 g.kg-1组大鼠主动回避次数明显增加，主动回避潜伏期明显缩短，被动潜伏期也明显缩短，有统计学意义（p＜0.05），见表2。
2.3对海马组织il6，tnfα影响 同空白组比较，模型组il6，tnfα明显上升（p＜0.01）提示ad发病过程中可能有il6，tnfα的参与。同模型组比较，模型+阿司匹林3，10 mg.kg-1+黄芪颗粒3 g.kg-1组il6，tnfα下降（p＜0.05），模型+阿司匹林30 mg.kg-1+黄芪颗粒3 g.kg-1组il6，tnfα下降显著（p＜0.01），见表2。
3讨论
目前研究认为炎症参与ad可能是一个相互作用的过程：β淀粉样沉积导致小胶质细胞在淀粉样斑块周围大量分布，激活细胞内大量的信号反应途径，最后引起许多细胞毒性的炎症因子的产生如il1、il6、tnfα等细胞因子释放增加，最终导致神经元凋亡或死亡。而炎性因子升高，抗炎因子下降又促进了炎症反应，诱发ad发病或加速ad病程进展［7］。能否通过干扰相关炎症因子而抑制ad的形成值得研究。tnfα和il6是两个最重要的炎性细胞因子，在中枢神经系统炎症中主要由活化的小胶质细胞和血源性巨噬细胞产生。ad患者脑脊液中，il6水平明显增高，对ad患者的皮质研究发现，il6的脑内表达显著增多，且与ad的老年斑之同呈现强烈的相关性，提示il6参与了老年斑的形成［8］。对ad患者的病历检查结果证实．海马各区tnfα呈高表达，并认为它是介导ad脑内炎症性病理反应的关键性因子［8］。因此，若能抑制tnfα和il6的分泌，就可减慢甚至调整这种恶性循环，从而减少脑神经细胞的死亡或凋亡，而达到防治ad的目的。
阿司匹林是一种传统解热镇痛抗炎药物，目前阿司匹林治疗ad的研究主要集中在流行病学调查和小量的临床观察上，实验性研究较少，黄芪中所含得黄芪多糖除有抗炎作用外，还具有抗自由基、改善微循环、增强免疫力、抗自由基等作用。此外，黄芪具有抑制no的生成和抑制cox1和cox2的作用，在抗炎机制上可能与阿司匹林产生协同效应［10］。因此本实验通过脑立体定位将具有神经毒性作用的聚集状态aβ140注入海马区致脑组织损伤复制ad动物模型，观察合用阿司匹林与黄芪颗粒对ad是否有治疗作用，其治疗作用是否与抑制炎症因子有关，目前国内尚无相关报道。表1 阿司匹林与黄芪颗粒合用对ad大鼠寻找平台潜伏期和跨平台次数的影响（注：同空白组比较，**p＜0.01同模型组比较，#p＜0.05。表2 阿司匹林与黄芪颗粒合用对大鼠ad模型条件学习记忆能力及海马il6,tnfα表达影响注：同空白组比较，**p＜0.01同模型组比较，#p＜0.05,##p＜0.01 实验结果显示阿司匹林10，30mg·kg-1+黄芪颗粒3g·kg-1组显著缩短平台潜伏期，明显增加主动回避次数，缩短主动回避潜伏期和被动潜伏期（p＜0.05），il6,tnfα分泌被抑制（p＜0.05），提示阿司匹林合用黄芪颗粒有一定改善ad大鼠记忆的作用，其作用可能与抑制炎症因子il6,tnfα释放有关。但是否与其他因素有关尚须进一步研究。
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