sirt1在贲门癌中的表达及临床病理学意义研究
【关键词】 sirt1；贲门癌；预后
【摘要】 目的 研究sirt1表达与贲门癌临床病理学间的关系及对预后的影响。方法 应用组织芯片技术和免疫组化方法检测176例贲门癌组织和32例正常贲门组织中sirt1、p53、ki67蛋白的表达情况。结果 sirt1在贲门癌中的阳性表达率高于正常贲门中的阳性表达率（p<0.01）；176例贲门癌中，sirt1在淋巴结有转移组中的表达高于淋巴结无转移组（p<0.01）;且sirt1表达与贲门癌tnm分期呈正相关（p<0.05）。sirt1阳性组的ki67蛋白水平高于sirt1阴性组（p<0.05）。其中90例有随访资料的贲门癌病例中，sirt1阳性患者的3年生存率及平均生存时间，低于sirt1阴性表达患者（p<0.05）。结论 sirt1在贲门癌组织中存在过表达，与淋巴结转移、tnm分期、肿瘤增殖状态以及预后相关，可能成为判定贲门癌恶性程度及评估预后的生物学指标。
【关键词】 sirt1；贲门癌；预后
study on the clinicopathologic significance and expression of sirt1
feng anning,fan xiangshan,huang qin,et al.
department of pathology, gulou clinical medical college affiliated to nanjing medical university, nanjing 210008, china
【abstract】 objective to investigate the expression of sirt1 in gastric cardia carcinoma and its correlation with clinicopathologic features and patients' prognosis. methods tissue microarray (tma) technique and immunohistochemistry stain were used to detect the expression of sirt1, p53, and ki67 in 176 cases of gastric cardia carcinoma tissues and 32 cases of normal gastric cardiac region tissues.results the positive rate of sirt1 expression in gastric cardia carcinoma cases was significantly higher than that in normal gastric cardiac region tissues (p<0.01); in the 176 cases of gastric cardia carcinoma,the expression of sirt1 in lymph node metastasis group was significantly higher than that in the group without lymph node metastasis(p<0.01),which was positively correlated to tnm stage(p<0.05); the protein levels of ki67 in sirt1 positive group were significantly higher than those in sirt1 negative group(p<0.05). in the 90 patients with complete followup information, the three-year survival rate and mean survival time of patients with positive sirt1 expression were significantly lower than those of patients with negative sirt1 expression (p<0.05).conclusion there exists overexpression of sirt1 in gastric cardia carcinoma,and the high expression of sirt1 is correlated with lymphatic metastasis,tnm stage,proliferative status and patients’ prognosis. sirt1 may be a biological parameter to evaluate the malignant degree of gastric cardia carcinoma and to forecast the patients' prognosis of gastric cardia carcinoma.
【key words】 sirt1; gastric cardia carcinoma; prognosis
沉默信息调节因子2 （silent information regulator 2, sir2）是依赖于尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinmide adentine dinucleotide,nad+）的组蛋白去乙酰化酶，属第ⅲ类去乙酰化酶。WWW.11665.cOmsirt1是sir2的哺乳动物同源物，在体内可将组蛋白及多种非组蛋白去乙酰化，调节基因表达及蛋白质功能，与神经变性疾病［1］、代谢相关疾病［2］的发生有关。近期研究显示，sirt1在许多人类恶性肿瘤中表达上调［3，4］，提示其可能参与了肿瘤的形成及进展过程。贲门癌是发生于胃食管连接部（gastroesophageal junction, gej）的恶性肿瘤，近年来因其发病率呈上升趋势而受到更多的关注。本研究以组织芯片技术及免疫组化染色方法，检测sirt1、p53和ki67在贲门癌以及正常贲门部黏膜中的表达情况，分析sirt1表达与临床病理学参数以及预后间的关系，探讨sirt1在贲门癌发生进展中可能起到的作用。
1 资料与方法
1.1 一般资料
标本来源于南京大学医学院附属鼓楼医院2005至2007年贲门癌存档标本176例，患者均为首次发现贲门癌，术前未经任何治疗。176例患者中男132例，女44例；年龄41～90岁，平均年龄64岁；肿瘤最大直径≥5 cm 89例，＜5 cm 87例；有淋巴结转移128例，无淋巴结转移48例。tnm分期ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ期分别为17、31、103、25例。按组织学类型分类，高分化腺癌1例，中分化腺癌79例，低分化腺癌79例,粘液细胞癌7例,粘液腺癌10例，所有病例资料完整，标本经10%中性甲醛溶液固定，常规处理后石蜡包埋。对照组为贲门部正常胃黏膜组织32例，均经镜下证实未被肿瘤细胞侵袭。176例中有90例具有3年随访资料。
1.2 组织芯片构建
组织微阵列打孔系统购自美国beecher instrument公司。所有病例复诊后根据he切片标记出典型病变范围，应用组织微阵列打孔仪在每例组织典型病变处取样，分别移植至受体蜡块上，取样针直径1 mm，制成13×16个点的组织芯片蜡块，连续4 μm厚切片；按同样方法构建另一个包含相同病例且阵列设计相同的组织芯片蜡块以便实验重复。
1.3 免疫组化染色
组织芯片脱蜡至水，0.01 mol/l edta（ph=8）高压抗原修复，依照envision试剂盒说明书行免疫组化法染色。所用sirt1（克隆号: e104）购自美国sigma公司；p53（克隆号：do7），ki67 (克隆号：7b11)购自北京中杉公司。染色中采用pbs代替一抗作为阴性对照，已知阳性切片为阳性对照。每个检测指标均在另一张组织芯片上重复1次。
1.4 结果判定
无背景着色情况下以胞核出现黄色或棕色颗粒者为阳性染色。如染色不连续，明显减弱或缺失，则被判定为不正常染色。对同一病例的肿瘤细胞阳性染色数量取2张组织芯片染色结果的平均值，并作为该病例最终评分。sirt1、p53结果判定标准：肿瘤细胞中阳性染色数量≥30%为阳性结果，＜30%为阴性结果［5］；ki67结果判定标准：记数阳性肿瘤细胞数所占的比例，以5%为单位进行半定量评估［6］。
1.5 统计学分析
应用spss 15.0统计软件，计数资料采用χ2检验，相关性采用spearman相关分析，生存数据进行kaplanmeier分析，并绘制生存曲线图，应用logrank检验差异性，p<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 sirt1在贲门癌组织和贲门部正常胃黏膜组织中的表达
sirt1阳性着色定位于胞核，呈黄色或棕黄色（图1）。176例贲门癌中呈阳性表达81例（46.02%），32例贲门部正常黏膜中呈阳性表达6例（18.75%），2组差异有统计学意义（p<0.01）。
2.2 sirt1在贲门癌组织中表达与贲门癌临床病理学参数间的关系
176例贲门癌组织中，sirt1的表达在性别、年龄、肿瘤大小、浸润深度、组织学分化中差异无统计学意义（p＞0.05），在淋巴结转移、分期方面差异有统计学意义（p<0.05或<0.01），sirt1表达与贲门癌分期呈正相关（rs=0.159, p<0.05）。见表1。表1 sirt在贲门癌中的表达及其临床病理学联系（略）
2.3 贲门癌中sirt1表达与p53及ki67表达的关系
sirt1阳性表达病例中，p53阳性表达率为45.68%（37/81），与sirt1阴性病例中的p53阳性率50.53%(48/95)相比，差异无统计学意义（p>0.05）。 ki67的li指数在sirt1阳性病例中平均值为46.1728, sirt1阴性病例中均值为38.0000，sirt1阳性病例中ki67的li均数高于sirt1阴性病例，差异具有统计学意义（p=0.041）。贲门癌中p53及ki67表达情况见图2、3，sirt1与ki67及p53表达水平间的关系。见表2。表2 贲门癌中sirt1的表达与p53，ki67之间的关系例（略）
2.4 sirt1的表达与贲门癌预后之间的关系
176例贲门癌病例中，失访86例。90例随访资料完整病例sirt1阳性者46例， 1、2、3年生存率(survival rate)分别为80.4%，59.7%, 48.6%,平均生存时间 (mean survival time)为29.9个月；44例sirt1阴性表达病例的1、2、3年生存率分别为 88.6%，78.6%, 71%,平均生存时间为39.8个月。经logrank分析差异有统计学意义（p<0.024）。生存曲线见图4。
3 讨论
本研究结果提示，sirt1可能参与了贲门癌的形成和增殖，并可能成为判断肿瘤恶性程度及预后的指标。sirt1与细胞存活，分化,代谢，细胞凋亡和细胞周期等相关。细胞学实验证明sirt1参与了肿瘤细胞的放化疗耐受［7］，提示sirt1可能在肿瘤发生及进展中起到促进作用。本实验结果显示sirt1可能参与了贲门癌的发生和进展，其效应可能为促进作用。原因为：（1）sirt1在贲门癌组织中表达增高；（2）sirt1的表达与肿瘤细胞中的ki67水平呈正相关；（3）sirt1阳性病例比sirt1阴性病例预后差，且sirt1表达与肿瘤分期、淋巴结转移相关。但也有研究发现，在小鼠结肠癌模型中，sirt1起到的作用是一个肿瘤抑制因子而非促进因子［8］，另外亦有研究发现sirt1在乳腺癌中表达为降低而非增高［9］，与本实验结果相反。以上相互矛盾结论产生的原因可能是由于不同组织中sirt1表达含量及蛋白活性有差异，且sirt1的底物众多，许多底物还尚待证实。
p53在体内有野生型和突变型两种。野生型p53蛋白具有抑癌作用，突变型p53编码的蛋白由于丧失其抑癌功能，可导致细胞无限增殖而引发肿瘤。sirt1能通过对野生型p53蛋白第283位赖氨酸残基的去乙酰化来下调p53活性，以减少dna损伤或应激条件下的细胞凋亡［10］，陈虹等［11］研究发现，p53基因的突变与食管贲门部多源癌的发生具有相关性。近年研究发现，p53突变与sirt1也有一定关系。jang等［5］用免疫组化方法检测104例弥漫大b细胞淋巴瘤的p53和sirt1表达情况，发现p53和sirt1水平存在相关性，且都与生存率及生存期相关。由于免疫组化检测到的都是突变型p53蛋白，由此结果推测sirt1与p53突变在弥漫大b细胞淋巴瘤的预后中可能存在相互影响的协同作用。此外，突变型p53还可间接调控sirt1的表达，机制是通过调节mirna中的mir34a的水平，其中mir34a是非编码rna中的一类，可影响sirt1基因的转录［12］。由以上研究结论推测，突变型p53与sirt1之间可能存在着一种负反馈联系，在无p53突变的肿瘤中，sirt1可能在癌变及进展中起到了关键作用。然而本实验中，p53和sirt1的核染色情况未见显著相关性，推测在贲门癌中，sirt1与p53突变间的相互作用并不是其参与肿瘤形成的主要作用。可能是由于sirt1在p53和sirt1表达的调节机制复杂，且肿瘤组织类型不同其发生机制也不同。
目前研究支持sirt1促进了细胞增殖和肿瘤生长，机制为通过调控ras促分裂原活化蛋白激酶（rasmitogenactivated protein kinase, rasmapk)［13］、erk/s6k1等［14］细胞信号通路的活性。本实验结果与此结论一致。ki67是增殖细胞核抗原，其阳性着色的细胞百分比可用来客观评价细胞的增殖状态。本实验中,贲门癌组织中sirt1阳性组的ki67水平明显高于sirt1阴性组，表明在sirt1阳性病例中，更多的肿瘤细胞处于增殖活跃状态。此结果提示sirt1参与了贲门癌细胞增殖和生长，效应可能是促进作用而非抑制作用。
近年来越来越多的关于贲门部肿瘤的研究被各国研究者报道，贲门癌在组织学、生长方式、表型、细胞分化等方面上具有多样性特征［15］。和非贲门部癌相比，贲门癌多有淋巴结转移，预后更差［16］。至今尚无用于评估贲门癌预后的单独指标。本实验结果显示，sirt1在有淋巴结转移病例中的阳性表达率，较无淋巴结转移病例中的阳性表达率高，差异具有统计学意义，且sirt1水平与tnm分期呈正相关，分期越高的贲门癌组织中sirt1阳性病例数越多，推测sirt1可能通过某种机制促进肿瘤淋巴结转移，进而影响到肿瘤分期。另外，生存分析结果提示，sirt1阳性表达的病例其总生存期、3年生存率均低于sirt1阴性病例，提示sirt1阳性表达的肿瘤其恶性程度更高，预后较差。以上结果显示，sirt1可能作为用来评估贲门癌恶性程度及临床预后的生物学标记物。
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