2型糖尿病大鼠肺组织基质金属蛋白酶2、9及其抑制因子1的表达变化
【关键词】 糖尿病；肺纤维化；基质金属蛋白酶2；基质金属白酶9；基质金属蛋白酶抑制物1
【摘要】 目的 通过检测2型糖尿病大鼠肺组织中基质金属蛋白酶2（mmp2）、基质金属蛋白酶9（mmp9）及基质金属蛋白酶抑制因子1（timp1）的表达变化，探讨mmp2、mmp9及timp1在糖尿病肺损伤中的作用。方法 通过高糖、高脂饮食加腹腔注射小剂量链脲佐菌素（streptozotocin,stz）的方法，建立2型糖尿病大鼠模型，采用光镜动态观察12 周、24 周时对照组、糖尿病组的大鼠肺组织的形态学改变，用masson三色染色观察肺组织胶原沉积情况，应用免疫组织化学方法检测2组大鼠肺组织mmp2、mmp9及timp1的动态表达变化情况。结果 糖尿病大鼠肺组织胶原含量明显增多，糖尿病大鼠肺组织mmp2、mmp9、timp1表达增多，同时mmp2/timp1、mmp9/timp1比例也增加。随病情进展，上述变化更加明显。结论 糖尿病大鼠出现了肺间质纤维化，mmp2、9及timp1表达增多及其比例紊乱参与了糖尿病肺组织病变的发生发展，可能是糖尿病肺纤维化发生的机制之一。
【关键词】 糖尿病；肺纤维化；基质金属蛋白酶2；基质金属白酶9；基质金属蛋白酶抑制物1
changes of mmp2, mmp9, timp1 in lung tissue of type 2 diabetic rats
mu weixin,shen yaxin,cui shijie,et al.
department of endocrinology,the fourth hospital of hebei medical university, shijiazhuang 050000, china
【abstract】 objective to investigate the changes of mmp2, mmp9, and timp1 in lung tissue of diabetic rats,and to explore the roles of mmp2, mmp9, timp1 in lung injury of diabetic rats.methods the experimental models of type 2 diabetic rats were established by injecting streptozotocin (stz) and feeding high fat and glucose food, then the changes of morphology in the lung of rats were observed by light microscope at 12 weeks and 24 weeks respectively,and the collagen accumulation of lung was observed by masson trichrome staining ,and the levels of mmp2,mmp9 and timp1 in lung were detected by immunohistochemistry.results the amount of collagen fibre was increased obviously in lung tissue of diabetic rats, the expression of mmp2, mmp9, timp1 and the ratio of mmp2/timp1,mmp9/timp1 was also increased in lung tissue of diabetic rats. with the progression of pathological changes, the changes became much more obvious.conclusion there is pulmonary fibrosis in diabetic rats. the changes of mmp2,mmp9,timp1 and the ratio of mmp2/timp1，mmp9/timp1 in lung tissue of dibtetic rats may be related to lung tissue pathological changes ,which may be one of the mechanisms for diabetic lung fibrosis.
【key words】 diabetes mellitus; lung fibrosis; matrix metalloproteinase2；matrix metalloproteinase9; inhibitor of matrix metalloproteinases1
在20世纪70年代schuyler等［1］就首次提出肺脏可能是糖尿病（diabetes mellitus, dm）的靶器官之一，但发病机制尚不清楚。wWw.11665.CoM以往研究发现糖尿病患者存在肺通气功能障碍、弥散功能障碍，易于发生肺纤维化、合并感染等。近年来的研究表明，基质金属蛋白酶（mmps）及其抑制因子(timps)的异常表达在器官纤维化中起重要作用，但在糖尿病肺损伤尤其是在糖尿病肺纤维化中的作用未见报道。本实验拟通过对实验性糖尿病大鼠肺组织mmp2、mmp9及timp1的动态观察，探讨糖尿病肺损伤的可能发生机制。
1 材料与方法
1.1 一般材料
8周龄健康雌性sprague dawley 大鼠50只，清洁级，体重180～250 g，由河北医科大学实验动物中心提供，按清洁级大鼠的要求饲养，自由进食水。
1.2 方法
1.2.1 2型dm大鼠的建立：完全随机的方法将50只雌性sd大鼠分为对照组和dm组。12 h光照，自由食水。对照组20只：普通饲料喂养。6周时腹腔注射0.1 mmol/l ph值4.4的等体积枸橼酸缓冲液，分别于12周、24周腹主静脉取血，宰杀，留取肺标本。dm组30只：高糖高脂饲料，6周时，大鼠腹腔注射小剂量链脲佐菌素（30 mg/kg，溶于0.1 mol/l枸橼酸缓冲液中，ph值4.4）。8周时，断尾取血测血糖，糖耐量异常者入选（共成模24只，成模率为80%）。糖尿病模型建立后，每周监测血糖1次，不符合标准者弃去。分别于12周、24周禁食12～14 h测定血糖后，盐酸氯氨酮100 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，腹主静脉取血用于测定胰岛素和血脂。打开胸腔，迅速取出肺脏，冰0.9%氯化钠溶液冲洗，剪除胸膜及血管，取部分肺组织置于10%中性甲醛固定，脱水，石蜡包埋，常规切片，供he、masson染色和免疫组化分析。
1.2.2 血脂、血糖和胰岛素的测定：①血脂采用德国拜耳1650全自动生化分析仪测定，血糖采用美国强生血糖仪测定，胰岛素采用放免法测定；②免疫组化法检测mmp2、mmp9及timp1 简述步骤如下：切片常规脱蜡至水，0.01 mol/l pbs 清洗3次，5 min/次，0.3%甲醇过氧化氢室温下孵育20 min，蒸馏水清洗清洗3次， 5 min/次， 0.1 mol/l枸橼酸缓冲液（ph值6.0）微波炉内修复98℃维持20 min，冷却至室温，10%山羊血清，37℃温箱湿盒内孵育30 min，滤纸吸去多余血清，加入一抗（兔抗mmp2 1∶100； mmp9 1∶100； timp1 1∶100），0.01 mol/l pbs清洗3次， 5 min/次，滴加生物素化二抗（山羊抗鼠或抗兔）工作液，37℃温箱湿盒内孵育30 min，0.01 mol/l pbs清洗3次， 5 min/次，滴加辣根过氧化物酶标记链酶卵白素工作液（三抗），37℃温箱湿盒内孵育30 min，0.01 mol/l pbs 清洗3次， 5 min/次，dab显色2～5 min，自来水充分冲洗终止显色，梯度乙醇脱水，二甲苯ⅰ、ⅱ、ⅲ各15 min 透明中性树胶封固，阴性对照用pbs替代一抗，其余步骤同上。在细胞浆和（或）细胞膜呈棕黄或黄色颗粒表达为阳性反应。免疫组化试剂盒均购自北京中山生物技术有限公司。③ masson染色：胶原纤维呈绿色，胞浆和红细胞呈红色，胞核呈蓝黑色。④ he染色：肺组织做6 μl连续切片。
1.3 统计学分析
应用spss 10.0统计软件，计量资料以±s表示，采用t检验,变量之间的关系采用直线相关分析方法，p＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 12周时dm组大鼠空腹血糖（fbg）、胰岛素、三酰甘油（tg）较同期对照组大鼠明显增加（p＜0.05），胆固醇(tc)变化不明显。24周时dm组大鼠的fbg、胰岛素、tg、tc较同期对照组均显著升高（p＜0.01）。dm组12周与24周比较，tg、tc均明显增加（p＜0.01），fbg和胰岛素水平2组差异无统计学意义（p>0.05）。见表1。表1 2组不同时间生化指标变化比较（略）注：与对照组比较,*p<0.05,#p<0.01；与12周比较，△p<0.01
2.2 光镜下可见对照组大鼠肺泡分布均匀，结构完整，由单层肺泡上皮和基膜组成，相邻肺泡之间少量结缔组织。12周dm大鼠肺组织结构紊乱，支气管壁、肺泡壁及肺泡间隙增厚，肺泡上皮细胞显示不清，肺泡萎缩、塌陷，肺间质和血管周围细胞外基质增多，成纤维细胞增多，并有炎性细胞浸润。24周dm大鼠的上述病理改变更加显著，可见肺泡间隔明显蓝色胶原沉积，局部肺实变，呈肺纤维化病变。见图1。
2.3 masson染色对照组大鼠肺间质之间、血管周围有少量胶原纤维。12 周时dm组大鼠肺间质胶原纤维增多，排列紊乱，毛细血管周围胶原物质增多，胶原面密度积分为（0.08±0.02），高于同期对照组大鼠肺组织胶原面密度积分（0.05±0.06），但无统计学意义（p>0.05）。随着dm病程延长，上述改变加重，24周时肺组织结构紊乱，大量胶原纤维沉积，呈索状或丛状分布，肺泡萎缩，甚至被胶原纤维取代。24周时dm组大鼠肺脏胶原面密度积分为（0.27±0.03），明显高于对照组大鼠（0.08±0.03，p＜0.01）；与12周比较，24周时dm大鼠肺脏胶原面密度积分亦明显增高（p＜0.01）。见图2。
2.4 免疫组化结果
2.4.1 mmp2 免疫组化结果：对照组大鼠的支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞、间质细胞及少数血管内皮细胞可见弱阳性的表达，多以胞浆为主，胞核中极少见阳性免疫反应。12周dm组大鼠阳性表达稍增加，阳性染色见于支气管细胞、肺间质内间质细胞、肺泡间隔、肺泡上皮细胞、肺泡腔内的巨噬细胞、血管内皮细胞，染色浅；24周dm组大鼠在肺组织上述部位表达明显增多，可在胞核及胞浆表达，为棕黄色颗粒，胞核的棕黄色颗粒颜色较深，可见团块状分布，胞浆颜色较浅。12周dm组大鼠阳性染色光密度值高于同期对照组（p＜0.01）。24周dm组大鼠阳性染色光密度值亦明显高于同期对照组（p＜0.01）。与12 周比较，24周时dm组大鼠阳性染色光密度增高，有统计学意义（p＜0.01）。见图3、表2。
2.4.2 mmp9免疫组化结果：对照组大鼠的支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞、间质细胞及少数血管内皮细胞可见mmp9弱阳性的表达，胞浆、可见阳性免疫反应。12周 dm组大鼠阳性表达稍增加，阳性染色见于支气管细胞、肺泡上皮细胞、肺巨噬细胞、血管内皮细胞，染色浅；24周 dm组大鼠在肺组织上述部位表达明显增多，可在胞浆表达，为棕黄色颗粒，胞核的棕黄色颗粒颜色较深，可见团块状分布，胞浆颜色较浅。12周 dm组大鼠阳性染色面积增加，光密度值为明显高于同期对照组大鼠（p＜0.01）。24周 dm组大鼠阳性染色光密度值明显高于同期对照组大鼠（p＜0.01）。与12周比较，24周时dm组大鼠阳性染色光密度明显增高，差异有统计学意义（p＜0.01）。见图4，表2。表2 2组不同时间肺组织内mmp2、mmp9、timp1比较（略）注：与对照组比较，*p<0.01；与12周比较，#p<0.01
2.4.3 timp1免疫组化结果：对照组大鼠肺泡上皮、支气管上12周对照组12周dm组24周对照组24周dm组皮细胞膜及细胞浆有弱的阳性表达。12周dm组大鼠在上述组织表达增加，24周dm组大鼠表达明显增加，面积增加，染色加深，肺泡上皮表达量增多，且胞膜表达多于胞浆表达。12周dm组大鼠阳性染色面积光密度值明显高于同期对照组大鼠（p＜0.01）；24周dm组大鼠阳性染色面积光密度值明显高于同期对照组大鼠（p＜0.01）。与12周比较，24周时dm组大鼠阳性染色光密度升高，差异有统计学意义（p＜0.01）。见图5、表2。
3 讨论
近几十年来，随着社会的进步，人们的生活水平不断地提高，dm的发病率及患病率快速增高，严重的危害人们的健康。目前，人们对dm所导致的心、脑、肾、神经病变、眼底病变等慢性并发症进行了广泛的研究，但对dm引起的肺损伤研究较少，认识不够深入。早在20世纪70年代schuyler等［1］就首次提出肺脏可能是dm的靶器官之一。 随着dm并发症研究的深入，dm肺部损害已经越来越受到关注。dm患者存在不同程度的限制性、阻塞性或混合性通气障碍及弥散障碍，易发生肺部感染甚至肺纤维化［2］。但发生机制尚不清楚。
mmps因其主要作用于细胞外基质并含有锌或钙离子而得名，是一组对基质有广泛降解和调节动态平衡的蛋白酶类大家族，迄今发现28种基质蛋白酶类，其中明胶酶（mmp2、mmp9）主要降解明胶、ⅳ、ⅴ、ⅶ、ⅹ胶原、纤维连接蛋白等细胞外基质。在肺间质纤维化的发生发展中起重要作用［3，4］。timps是mmps的特异性抑制剂，能与mmps特异性结合，使之失活并参与了细胞外基质的代谢［5］。gibbs等［6］发现timps在肺损伤疾病早期具有抗肺损害作用，但是在疾病的晚期，mmps对细胞外基质降解受到timps(其表达相对高于mmps) 的抑制，导致细胞外基质的稳定沉积，具有促肺纤维化的作用。还有研究发现二者的比例失衡是肺纤维化发生发展的关键因素。在肺纤维化初期，即肺泡炎阶段，mmp2/timp1的比例增加，致使其降解作用增强，造成肺组织的损伤，触发了肺纤维化的发生［3，7］，在后期即纤维化阶段，mmp2/timp1的比例下降，其降解作用减弱，基质沉积增加，形成稳定的肺纤维化［7-9］。我们参照郭啸华等［10，11］的方法并加以改进，用高脂高糖饮食加腹腔注射小剂量链脲佐菌素(30 mg/kg)的方法制作2型dm动物模型，模仿2型dm的病理生理过程，造成肺损伤：首先高糖高脂饮食喂养，使之出现胰岛素抵抗，高胰岛素血症，再用小剂量链脲佐菌素损伤胰岛β细胞，导致胰腺的代偿性分泌胰岛素障碍，使糖代谢发生异常，最终出现高血糖、高血脂、高胰岛素血症、肥胖等一系列的2型dm的临床特征。其间通过光镜观察肺组织病变的情况，动态观察肺部病变与mmp2、mmp9及timp1的变化，以探讨其在2型dm大鼠肺纤维化中的作用。
我们的研究发现，dm大鼠肺组织病理学改变为毛细血管壁基底膜不同程度的增厚，肺泡壁及肺泡间隙增厚，甚至出现肺泡萎陷，结构紊乱。masson三色染色显示，12周dm大鼠较对照组肺组织中胶原纤维明显增多，24周时更加明显，肺泡间隔、支气管基底膜及毛细血管基底膜有大量胶原纤维沉积，着色深，呈索状或丛状分布。胶原和弹性蛋白的增生使泡隔明显增宽，同时还造成肺泡腔的塌陷和血管腔的狭窄甚至闭锁。这一实验结果说明dm大鼠的肺组织存在明确的病理改变及细胞外基质和胶原纤维成分沉积增多，这样一方面使气体弥散面积减少，另一方面影响了通气血流比，提示这些病理改变可能是造成dm肺弥散功能障碍、肺顺应性降低甚至发生肺纤维化的病理生理基础。同时表明肺脏也是dm靶器官之一。
我们同时发现，12周、24周时dm大鼠肺组织mmp2、 mmp9、 timp1与对照组比较均有明显增高。提示了这些细胞因子参与了dm损伤及肺纤维化的发生发展。近年来，研究发现mmps与肺纤维化密切相关［12-14］。有研究表明即使是在空腹血糖调节受损和糖耐量减低阶段,体内mmps 水平便可开始升高了［15］ 。另有研究结果表明，肺纤维化早期mmp2、 mmp9在肺成纤维细胞、上皮细胞、巨噬细胞和中性粒细胞内有不同程度的增加。同时，mmps的变化一般伴随有timps的改变，特发性肺纤维化的不同细胞内可检测到timp1、2、3、4，mmp2、mmp9，胶原酶1、2，mt1mmp等［9］。我们的研究结果发现timp1、mmp2、mmp9在dm肺组织的不同细胞内可检测到。我们同时也发现，mmp2/timp1、mmp9/timp1的比例24周比12周增加。另有研究表明，各种原因引起的肺泡上皮损伤均可曝露肺泡基底膜［16］，而ⅳ型胶原是基底膜的主要成分，其可以激活和促进mmp2和mmp9的分泌［17］。
本研究结果表明，肺脏是糖dm损伤的又一靶器官。在dm肺组织损伤中，mmps及timps的表达增加及平衡破坏参与其中，引起细胞外基质进行性沉积和肺组织纤维化的发生。
【参考文献】
1 schuyler m, niewoehner d, inkley s, et al. abnormal lung elasticity in juvenile diabetes mellitus. am rev resp dis,1976,113:3741.
2 lange p,groth s,mortensen t,et al.diabetes mellitus and ventilatory capacity: a five year followup study.eur respir j,1990,3:288292.
3 corbel m,belleguic c,boichot e,et al. involvement of gelatinases (mmp2 and mmp9) in the development of airway inflammation and pulmonary fibrosis.cell biol toxicol,2002,18: 5161.
4 ji young kim, hyun cheol choeng,cheolmin ahn,et al.early and late changes of mmp2 and mmp9 in bleomycininduced pulmonary fibrosis .yonsei med j,2009,50:6877.
5 madtes dk, elston al,kaback la,et al.selective induction of tissue inhibitor of metalloproteinase1 in bleomycininduced pulmonary fibrosis. am j respir cell mol biol, 2001,24: 599607.
6 gibbs df, shanley tp, warner rl, et al. role of matrix metalloproteinases in models of macrophage dependent acute lung injury. evidence for alveolar macrophage as source of proteinases. am j respir cell mol biol,1999,20: 11451154.
7 马万里, 李元桂, 辛建保. 基质金属蛋白酶及金属蛋白酶组织抑制剂在肺纤维化中的变化.华中科技大学学报医学版,2002,31: 527529,533.
8 fukuda y, ishizaki m,kudoh s,et al.localization of matrix metalloproteinases1, 2, and 9 and tissue inhibitor of metalloproteinase2 in interstitial lung diseases.lab invest, 1998, 78: 687698.
9 selman m, ruiz v, cabrera s, et al. timp1, 2, 3, and 4 in idiopathic pulmonary fibrosis. a prevailing nondegradative lung microenvironment. am j physiol lung cell mol physiol,2000,279:562574.
10 郭啸华, 刘志红, 李恒. 高糖高脂饮食诱导的2型糖尿病大鼠模型及其肾特点.中华糖尿病杂志,2002,10:290294.
11 徐梓辉, 周世文, 黄林清, 等. 薏苡仁多糖对实验性2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗的影响. 中国糖尿病杂志,2002,10:4448.
12 朱礼星. 基质金属蛋白酶与肺纤维化. 现代临床医学生物工程学杂志,2001,7:382385.
13 basset f,ferrans vj,soler p, et al. intraluminal fibrosis in interstitial lung disorders.am j pat hol,1986,122:443461.
14 winkler mk, fowlkes jl. metalloproteinase and growth factor interactions: do they play a role in pulmonary fibrosis. am j physiol lung cell mol physiol, 2002, 283:111.
15 沈庆乐, 张存琪. 血清基质金属蛋白酶与糖尿病血管病变的关系. 中国微循环,2004,8:349.
16 roa w,chen h ,alexander a ,et al. enhancement of radiation sensitivity with bh3i1 in nonsmall cell lung cancer. clin invest med,2005,28:5563.
17 odaka c, tanioka m,itoh t.matrix metalloproteinase9 in macrophages induces thymic neovascularization following thymocyte apoptosis. j immunol,2005,174:846853.
