转染livin对糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响
【关键词】 心肌梗死;缺血再灌注损伤;糖尿病;livin
【摘要】 目的 观察转染livin对糖尿病大鼠心肌缺血再灌注过程中livin、caspase3表达以及心肌细胞凋亡和心肌梗死范围的影响。方法 健康sd大鼠80只，应用小剂量多次链脲佐菌素(stz)注射法建立2型糖尿病大鼠模型，随机选取60只大鼠分为假手术组、缺血再灌注(ir)组、空载体组和livin组。假手术组不结扎冠状动脉;livin组开胸心肌内注射表达livin的逆转录病毒载体，24 h后行ir;空载体组开胸注射空载体，24 h后行ir。荧光定量pcr测定caspase3 mrna，livin mrna表达，用ttc染色法测定梗死范围，tunel 法测定凋亡心肌细胞。结果 ①荧光定量pcr检测到糖尿病大鼠心肌细胞有livin表达，空载体组及ir组livin表达均不增加;转染livin后大鼠心肌内livin表达明显增加(p<0.01)。②ir组caspase3表达明显增加，显著高于假手术组(p<0.01);与ir组相比，livin组caspase3 mrna表达水平显著降低(p<0.01)。③livin组心肌梗死范围较ir组显著减少(p<0.05)。④tunel法检测显示糖尿病大鼠ir过程中可见心肌细胞凋亡的发生，ir组较对照组显著增加(p<0.05);注射livin后则细胞凋亡的发生明显减少，与ir组比较差异显著(p<0.05)。WWW.11665.COm结论 心肌livin过表达可以抑制糖尿病大鼠心肌caspase3表达，抑制ir过程中心肌细胞凋亡的发生，缩小心肌梗死范围。
【关键词】 心肌梗死;缺血再灌注损伤;糖尿病;livin
糖尿病是冠心病独立危险因素，心肌细胞凋亡是引发糖尿病缺血性心脏疾病发生与发展的主要因素。急性心肌梗死(ami)合并糖尿病人群的死亡率也高于非糖尿病人群。ami后再灌注治疗可造成心肌缺血再灌注损伤(iri)细胞凋亡与心肌iri有关，如能抑制心肌细胞凋亡，则可以保护缺血心肌。caspase3是细胞凋亡调控的重要因子，livin是近年发现的凋亡抑制蛋白家族(iaps)的新成员，本研究拟转染表达livin的逆转录病毒载体对糖尿病大鼠心肌iri的影响及其机制，为临床治疗iri提供新的思路。
1 资料与方法
1.1 实验材料
工具酶及禽源性逆转录酶amv购于promega公司;marker dl2000购自takara公司;rna提取试剂盒、质粒小量提取试剂盒、胶回收试剂盒均购自qiagen公司;胎牛血清购自hyclone公司，链脲佐菌素(stz)、氯化三苯基四氮唑(ttc)和伊文氏蓝均购自sigma公司，fugene6(transfection reagent)转染试剂盒及细胞凋亡原位检测(tunel)试剂盒购于roche公司。表达livin的逆转录病毒载体由郑州大学基础医学院赵国强教授提供。
1.2 动物模型的建立
sd大鼠80只，体质量(250±50) g，由河南省实验动物中心提供，以高脂高糖饲料喂养(其中含10%蔗糖，10%猪油，5%胆固醇)，4 w后空腹腹腔一次性注射以柠檬酸缓冲液配制的1%stz溶液，剂量为40 mg/kg。继续高糖高脂饲料喂养，于注射后1、2个月测定体重和血糖。选择非空腹血糖16.7～25.6 mmol/l的大鼠作为造模成功的糖尿病大鼠。经检测模型成功大鼠共66只，随机选取其中60只大鼠,并分为缺血再灌注(ir)组，空载体组，livin组和假手术组，每组15只。ir组结扎左冠状动脉前降支(lad)，以结扎后心电图ⅱ导联st段抬高，相关缺血区域变苍白为成功。30 min后松开结扎线再灌注120 min，处死动物。livin组先开胸于lad结扎线上方注射livin载体50 μl(3.9×107/ml)，空载体组注射空载体50 μl,24 h后行ir过程。假手术组动物模型建立方法同上，在冠状动脉下穿线但不结扎。
1.3 实时荧光定量pcr检测
caspase3及livin mrna 按trizol 试剂盒提取鼠损伤区心肌组织总rna,以引物设计软件(oligo)六聚体为引物，以提取的总rna为模板，在amv催化下反转录出cdna。反转录体系如下：amv 酶1 μl，5×缓冲液6 μl，rnasin 1 μl，2.5 mmol/l 核苷酸dntps 2 μl，rna 5 μl，10 μmol /l随机引物1 μl，加depc处理水至总体积30 μl，42℃水浴1 h。各引物序列及扩增片段如下：livin： 上游 5′ atggggcctgagagtagggccag 3′，下游 5′ gacagaggccgaagctggcc 3′，169 bp;caspase3上游 5′ gtcgatgcagctaacctcag 3′，下游 5′ gacttagaatcacacacac 3′，156 bp;βactin：上游 5′ atggatgacgatatcgctgcg 3′，下游 5′ tccatatcgtcccagttggtg 3′，247 bp。实时荧光定量pcr根据试剂盒与扩增仪说明进行，每个标本扩增livin、caspase3基因同时都扩增βactin对照。
1.4 心肌梗死范围测定
再灌注结束时再次结扎lad，左室内注入2%伊文氏蓝2～3 ml，取出心脏，pbs冲洗，去除心房、右心室后低温(-80℃)保存。将冰冻后的心脏自心底向心尖垂直于心脏纵轴方向平均切成6片1 mm厚的环行切片，置于1% ttc的pbs 37℃孵育20 min。以湿重计算心肌缺血区(伊文氏蓝未染色而呈现砖红色)、梗死区(ttc 未染色而呈现苍白色)的重量。心肌梗死范围(%)=ttc未染区/伊文氏蓝未染区×100%。
1.5 tunel检测心肌细胞凋亡
实验结束后取出心脏，去除心房、右心室，4%多聚甲醛固定(4℃)，常规石蜡包埋，沿左室轴线横断面心尖上方4 mm每隔1 mm连续切取2张4 μm厚的切片。采用tunel法标记凋亡细胞核中的dna3′oh末端。实验同时加做不加tdt酶而其他条件相同的切片作为阴性对照。每一标本取3个不同部位的切片各一张，每张切片取10个视野，在400倍光镜下观察心肌细胞凋亡情况。计数每个视野tunel阳性细胞数和心肌细胞总数，以每视野阳性细胞数所占的百分比作为凋亡细胞指数(ai)，以10个视野的均值作为ai结果。
1.6 统计学处理
采用spss 10.0统计软件，计量资料以x±s表示，组间比较用t检验及单因素方差分析。
2 结 果
2.1 荧光定量pcr扩增结果
见表1。空载体组与ir组livin mrna与假手术组无差异，而livin组则高于假手术组和ir组(p<0.01)。livin组caspase3 mrna明显高于其他组，且空载体组及ir组也高于假手术组(p<0.01)。表1 各组心肌livin和caspaes3 mrna相对表达水平
2.2 心肌梗死范围测定结果
ir组心肌梗死范围为(22.91±1.97)%，livin组为(16.4±2.31)%，livin组较ir组明显缩小(p<0.05)。
2.3 心肌细胞凋亡
实验结果显示假手术组、空载体组、ir组、livin组细胞ai分别为1.43±0.71、17.2±0.56、16.35±4.40、4.70±1.49。ir过程中凋亡细胞数则明显增加， livin组心肌细胞凋亡明显减少，与ir组及假手术组比较均有差异(p<0.05)。
3 讨 论
研究已证实，糖尿病缺血型心脏病的产生与心肌细胞凋亡增加有关〔1～3〕。然而其机制仍不明确。caspase3是细胞凋亡调控的最后执行因子。本实验中可见ir过程中caspase3表达显著增加，表明其参与了ir，通过干预caspase3的表达，可以阻断细胞凋亡的进程。
iaps成员之一的livin可以特异的抑制caspase的活性，发挥抑制细胞凋亡的作用。livin含有杆状病毒iap重复序列(baculoviral inhibitor of apoptosis repeats，bir)和环锌指结构域(ring zinc finger domain，ring)，bir结构是结合和抑制caspase的关键部位，为livin抑制细胞凋亡的功能区域〔4～6〕，能够与caspase蛋白结合并有较强的抗凋亡功能。但是livin多分布在肿瘤组织，正常大鼠心肌仅有少量表达，转染外源性livin于大鼠心肌后可见局部livin高表达。
本研究发现livin在糖尿病大鼠心肌有表达，但呈低表达状态，给予外源性的livin注射于心肌内则可见较高表达。但是ir过程中caspase3的表达明显增多，应用表达livin的逆转录病毒载体干预后糖尿病大鼠心肌caspase3表达明显减少，表明表达livin的逆转录病毒载体在糖尿病大鼠心肌过表达后抑制了大鼠ir过程中caspase3的表达，转染表达livin的逆转录病毒抗体后心肌ir过程中细胞凋亡减少可能与此有关。
本实验结果提示表达livin的逆转录病毒载体有可能通过干预凋亡相关基因的表达，抑制心肌细胞凋亡，从而保护缺血心肌。转染表达livin的逆转录病毒载体，有望成为ir治疗的新途径。
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