【摘要】 目的 探讨体外受精―胚胎移植治疗周期中注射绒毛膜促性腺激素(hcg)日血清促卵泡生成素(fsh)、促黄体生成素(lh)、泌乳素(prl)、雌激素(e2)、孕激素(p)水平与卵子成熟、受精、卵裂、胚胎质量及妊娠的关系。方法 2003年8～12月在我院接受卵泡浆内单精子注射(icsi)治疗的48例不孕妇女，注射hcg前采用磁性分离酶免疫法测定血清fsh、lh、prl、e2、p的水平，观察其与卵子成熟、受精、卵裂、胚胎质量及妊娠的关系。结果 获卵数与e2的水平呈正相关;卵子的成熟率与lh呈负相关;卵裂率与e2、p呈正相关;将卵裂率分为高(≥90%)、中(80%～90%)、低(<80%)三组时，卵裂率高组e2、p的水平显著高于低组，卵裂率高组与中组e2、p的水平差异无显著性，中组与低组e2、p的水平差异无显著性;卵子的成熟率与血清fsh、prl、e2、p无关;受精率与血清fsh、lh、prl、e2、p均无关;卵裂率与fsh、lh、prl、p无关;优胚率与血清fsh、prl、e2、p无关;注射hcg日妊娠组血清fsh、lh、prl、e2、p的水平与未妊娠组相似。结论 在体外受精―胚胎移植超排卵治疗周期中，注射hcg日e2的水平能够反映卵巢对促排卵药物反应的高低，lh水平升高能够导致卵子的成熟率下降，卵裂率高的患者注射hcg日血清e2、p高于卵裂率低的患者，血清fsh、prl、e2、p的水平不影响卵子的成熟，血清fsh、lh、prl、e2、p的水平与受精率、优胚率、妊娠率无关。
【关键词】 体外受精―胚胎移植;血清性激素;受精率;卵裂率;妊娠
relationship between serum sex hormone levels and development of human embryos and pregnancy during in vitro fertilization and embryo transfer
ren haiqin,wang wenge,li wei,et al.
reproductive center,jinghua hospital,shenyang dongfang medical group,shenyang 110005,china
【abstract】 objective to study the relationship between serum sex hormone levels on the day of human chorionic gonadotropin (hcg) injection and oocyte maturation,fertilization,cleavage and embryos quality and pregnancy during in vitro fertilization and embryo transfer.methods 48 women underwent intracytoplasmic sperm injection (icsiet) mostly because of male factor under controlled hyperstimulation with gonadotropin releasing hormone antagonists/follicle stimulating hormone/human menopausal gonadotropin/human chorionic gonadotropin (gnrha/fsh/hmg/hcg).fsh，lh，prl，e2 and p in serum were measured by meia technology on the day of hcg injection.results the numbers of obtained oocytes was positive related with e2 level (r=0.797,p<0.01);the oocyte maturation rate was negative related with lh (r=0.571,p<0.01);the oocyte cleavage rate was positive related with e2 and p level (r=0.346,p<0.05;r=0.314,p<0.05);e2 and p level in oocyte cleavage rate≥90% group was higher than in oocyte cleavage rate<80% group (p<0.05),no significance was found for e2 p level between oocyte cleavage rate≥90% group and≥80%&<90% group (p>0.05),no significance was found between oocyte cleavage rate>80%&<90% group and<80% group (p>0.05);no significance was found for serum fsh lh prl,e2 and p level on the day of hcg injection between pregnant and nonpregnant group (p>0.05).conclusion e2 level of hcg injection is the marker of ovarian reactivity to hyperstimulation,high lh level can decrease oocyte maturation rate.the oocyte cleavage rate is positive related with e2 p level.the adequate e2 and p are the qualification of oocyte cleavage.the oocyte maturation rate is not related with fsh prl e2 p.the oocyte fertilization was not related with fsh lh prl e2 p.no significance difference is found in serum fsh,lh,prl,e2 and p level on the day of hcg injection between pregnant and nonpregnant group.
【key words】 in vitro fertilizationembryo transfer;serum sex hormone;fertilization rate;cleavage rate;pregnancy
目前，对于难治的不孕、不育如严重的输卵管阻塞、严重的少弱畸精子症等，手术及药物治疗是无能为力的，故临床采用体外受精―胚胎移植(ivfet或icsiet)治疗。WwW.11665.Com在体外受精―胚胎移植的治疗过程中，一般均采用控制性超排卵用药来促使多个卵泡发育，以期获得多个成熟卵子，多个质量好的胚胎供移植和冷冻，同时提高成功率。因此卵泡的发育、卵子的成熟、受精、卵裂及胚胎的发育潜能对妊娠结局至关重要。在超排卵用药过程中，随着卵泡的生长发育，下丘脑、垂体、卵巢所分泌的各种性激素的水平也在不断地发生变化，在卵泡的发育晚期，监测血清性激素水平的变化可以帮助决定取卵时间[1]，hcg注射日血清促卵泡生成素(fsh)、促黄体生成素(lh)、泌乳素(prl)、雌激素(e2)、孕激素(p)水平的不同可能会对卵子成熟、受精和胚胎质量等有一定影响，此项研究的结果目前尚存有争议。本研究选择的病例均为男方因素不育，排除了女方疾病可能会带来的影响，卵子受精方式均为卵泡浆内单精子注射(icsi)，此时卵子周围的卵丘和放射冠被脱掉，可以看清有无第一极体的存在，这使直接评估卵子的成熟状态成为可能[2]。本文研究的目的旨在探讨卵泡发育接近成熟时即注射hcg日血清性激素水平与卵子的成熟、受精、卵裂及胚胎的发育潜能及体外受精―胚胎移植结局的关系。
1 对象与方法
1.1 研究对象 2003年8～12月在我院接受icsi治疗的不孕患者48例，不孕原因主要为男方因素，女方年龄为24～36岁，缺乏明显的女方疾病，超排卵低反应者不包括在本研究的范围。
1.2 超排卵方案 采用促性腺激素释放激素激动剂/基因重组的促卵泡生成素结合尿促性素/绒毛膜促性腺激素(gnrha/rhfsh结合hmg/hcg)方案超排卵，在治疗前一个周期的黄体中期应用长效的gnrha 1.25mg降调节，在月经周期的3～5天开始使用促性腺激素进行控制性超排卵，用量依患者年龄及卵巢的储备功能决定，一般每天注射150～225u，有目的地控制和促进卵巢内多个卵泡的同步化发育和成熟。至月经第8天开始b超监测卵泡发育;当有1～2个卵泡直径达到至18mm时，清晨空腹采血测血清性激素，适时肌注hcg 10000u，hcg注射后34～36h在阴式b超引导下取卵。
1.3 血清性激素测定 注射hcg日血清fsh、lh、prl、e2、p的浓度采用磁性分离酶免疫测定法。本方法为酶免疫与磁性微粒分离技术相结合的一种测定方法：标本、标准品和质控血清中的激素与两种高亲和力的单克隆抗体起作用，酶标单克隆抗体与激素分子的一端结合，另一种荧光标记的单克隆抗体与激素分子的另一端结合，形成“三明治”结构。孵育后加过量的偶联荧光抗体的磁性微粒，它快速、特异地结合成荧光素标单克隆抗体复合物，不需离心，在磁场中沉淀，弃去上清液，洗涤后加基质液孵育，加终止液终止酶/基质反应，然后用光度计测量所生成的颜色强度，用内插法从标准曲线上求得激素的浓度。测定仪器为瑞士serono产品，所用试剂均为北京bioekon biotechnology提供。
1.4 卵子成熟度的评估、icsi、胚胎培养 将取出的卵子置于培养箱中培养，3h后脱去卵子周围的颗粒细胞和放射冠，对卵子进行成熟度评估，看到第一极体出现被认为是成熟卵子。卵子培养2h后用icsi方法进行受精，16～18h后评估受精情况，出现两个原核和两个极体为正常受精，受精后约48h见分裂成两个细胞或以上为卵裂，取卵后72h 5个细胞3分以上的胚胎被认为是优质胚胎。取卵后3天进行胚胎移植。移植后采用黄体酮40～60mg黄体支持治疗，移植后15天测定血、尿hcg，如果阳性被确定为生化妊娠，至孕6～8周b超检查显示宫内妊娠囊及胎心搏动为临床妊娠成功。
1.5 统计学方法 采用spss统计软件包分析结果，进行双变量相关分析，均数比较采用t检验，p<0.05认为具有统计学意义。
2 结果
2.1 icsi治疗情况 共48个周期行icsi治疗，平均刺激天数(11.50±0.18)天，平均gn用量(34.64±0.86)支，平均获卵率88.14%，卵子成熟率84.55%，受精率79.13%，卵裂率91.57%，优胚率48.91%，临床妊娠13例，临床妊娠率27.08%。
2.2 注射hcg日血清性激素水平与卵子成熟、受精、卵裂、胚胎发育及妊娠率的关系 获卵数与e2的水平呈正相关(r=0.769，p<0.01);卵子的成熟率与lh呈负相关(r=-0.571,p<0.01);卵裂率与e2、p呈正相关(r=0.343，p<0.05，r=0.314，p<0.05);将卵裂率分为高(≥90%)、中(80%～90%)、低(<80%)三组时，高组e2、p的水平显著高于低组(p<0.05)，高组与中组e2、p的水平差异无显著性(p>0.05)，中组与低组e2、p的水平差异无显著性(p>0.05)，见表1;卵子的成熟率与血清fsh、prl、e2、p无关;受精率与血清fsh、lh、prl、e2、p均无关(p>0.05);卵裂率与fsh、lh、prl、p无关，优胚率与血清fsh、prl、e2、p无关;注射hcg日妊娠组血清fsh、lh、prl、e2、p的水平与未妊娠组相似(p>0.05)，差异无显著性，见表2。
表1 不同卵裂率组各激素水平的比较 (略)
表2 妊娠组与未妊娠组各激素水平的比较 (略)
3 讨论
体外受精―胚胎移植成功的主要决定因素之一是产生适量的成熟卵泡、获得适量的成熟卵子、卵母细胞受精、获得优良的胚胎[3]。在相同方案的超排卵治疗中，血清性激素水平的差异是由于不同个体对促排卵药物的反应不同所致，许多学者试图将血清中性激素的浓度与卵母细胞的成熟、受精、胚胎发育和着床联系起来，但报道不一致。
本文采用同一种gnrha垂体抑制方案，排除了不同用药方案本身所带来的差异;研究对象的不孕原因均为男方因素，排除了女方其他疾病的干扰;另外，所选的病例均为接受icsi治疗者，这使直接评估卵子的成熟状态成为可能。
在自然周期中，卵泡内膜细胞和颗粒细胞在两种促性腺激素fsh和lh的作用下协同促成e2、p的合成、卵泡的生长、优势卵泡的形成及最后排卵，随着卵泡的渐趋成熟，e2分泌也逐渐增加，于排卵前形成第一高峰，对垂体促性腺激素产生正反馈，促成lh高峰，fsh水平亦有增高，lh峰后排卵，排卵前生长卵泡内的颗粒细胞亦能产生p，排卵后p分泌量开始增加，在排卵后黄体形成时达到高峰[4]。控制性超排卵周期中，多卵泡的发育产生高水平的血清e2，超声检查能直接显示卵泡的数目及大小，而血清e2水平的高低反映卵泡的分泌功能，e2水平与双卵巢内的卵泡数量及大小有关，代表卵巢对控制性超排卵的反应程度，间接反映卵母细胞的质量，监测血清e2水平的变化可以用于预测卵巢对促排卵药物的反应高低，预测卵巢的反应不良及卵巢过度刺激的发生[5]。本研究发现获卵数与e2的水平呈正相关，这与文献报道是相同的。
一些研究者认为[5，6]，注射hcg日血清孕酮水平>3.0ng/ml组的种植率及临床妊娠率降低，必要时可考虑放弃周期。e2、lh的水平对妊娠结局无影响，lh低组注射卵泡刺激素(fsh)剂量增加，获卵数较多，但受精率较低[7]。shulman a等[8]认为，血清孕酮升高使子宫内膜准备不充分而影响妊娠，另有学者如hofmann ge等[9]认为无此相关性。本组数据发现p水平升高并未影响妊娠率，不必取消周期，但因病例数尚少，尚需进一步证实。
本研究发现：卵子的成熟率与lh呈负相关。血清lh的水平反映降调节后垂体的压抑程度[10]，lh升高说明抑制的不够，这说明在卵泡发育晚期，lh升高提示将获得的成熟卵子数减少，也说明一少部分卵子即将成熟，这一点可以帮助判断取卵时间，也可以用来指导gnrha的用量。
本研究得出卵子的受精与血清fsh、lh、prl、e2无关，这可能由于用于icsi的卵子皆为脱颗粒后确认成熟的卵子，而排除了那些不成熟的卵子。
本研究得出卵裂率与e2、p呈正相关，卵裂率高组e2、p水平明显高于低组。icsi受精后的卵裂率三组平均为91.57%，有8.43%的卵子受精后没有继续卵裂。文献报道[11]，超排卵后多个卵泡发育导致血清e2、p水平均明显高于自然周期，一定的e2、p水平是卵泡发育、卵子成熟不可缺少的条件，并能为卵子受精后的分裂打下基础。
本研究中优胚率与血清fsh、lh、prl、e2无关，卵裂后胚胎进一步发育为优质胚胎，不仅需要卵子优良，还需要有好的培养环境等，影响因素很多。
本组研究得出注射hcg日妊娠组血清fsh、lh、prl、e2、p与未妊娠组相比差异均无显著性，这与有些文献的报道是一致的[12]。因为胚胎着床的影响因素较多，andersen[13]认为卵子成熟与胚胎着床是两个相关又独立的事件，即使是来自健康成熟卵泡的卵子也受子宫内膜的容受性、培养条件、精子质量等许多因素的影响。
在体外受精―胚胎移植超排卵治疗周期中，注射hcg日e2的水平能够反映卵巢对促排卵药物反应的高低;lh水平升高能够导致卵子的成熟率下降;卵裂率高的患者注射hcg日血清e2、p高于卵裂率低的患者;血清fsh、prl、e2、p的水平不影响卵子的成熟;血清fsh、lh、prl、e2、p的水平与受精率、优胚率、妊娠无关。
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