摘要】 目的 监测手足口病的病原体，为预防和控制肠道病毒感染提供依据。方法 采集手足口病患儿的粪便、肛拭子、咽拭子、疱疹液进行rtpcr定性，肠道病毒通用引物阳性的标本进行病毒分离;分离株用ev71和ca16的vp1基因的特异性引物进行rtpcr鉴定。结果 共收集患儿标本443份，肠道病毒通用引物阳性259份;做病毒分离256份，阳性150份，其中粪便158份，病毒分离阳性112份，阳性率为70.89%;肛拭子21份，病毒分离阳性10份，阳性率为47.62%;咽拭子65份，病毒分离阳性26份，阳性率为40.00%;疱疹液10份，病毒分离阳性2份，阳性率为20.00%。结论 粪便、肛拭子、咽拭子、疱疹液的分离率有显著差异，粪便分离率最高;ev71和ca16是引起小儿手足口病的主要病原体，死亡病例全部是由ev71病毒引起。
【关键词】 手足口病; 肠道病毒感染; 儿童
surveillance on etiological agent of hand, foot and mouth disease (hfmd) of children in guangdong province in 2008 guo xue, zheng huanying, mo yanling, zhou huiqiong, liu leng, ke changwen, deng xiaoling. center for disease control and prevention of guangdong province, guangzhou 510300, china
【abstract】 objective to investigate the major etiological agent of hand, foot and mouth disease (hfmd) in children, in order to provide a clue to preventing and controlling the enterovirus infection. methods 443 specimens of the stool, anus swabs, throat swabs and vesicle fluid were collected from hfmd patients and tested by rtpcr. the virus was isolated from the positive specimen of enterovirus universal primer. the isolating virus stains were identified by rtpcr assay with two specific primer pairs for vp1 genes of ev71 and ca16 respectively. results there were 259 positive specimens of enterovirus universal primer confirmed by virus isolation. 150 of specimens showed pathological changes. 112 specimens showed pathological changes in the 158 stool specimen (70.89%), 10 specimens showed pathological changes in the 21 anus swabs specimen (47.62%), 26 specimen showed pathological changes in the 65 throat swabs specimens (40.00%), and 2 specimens showed pathological changes in the 10 vesicle fluid specimens (20.00%). conclusions the isolating rate of the virus has obvious difference in the stool, anus swabs, throat swabs and vesicle fluid, the isolating rate being highest in the stool. ev71 and ca16 are major pathogens of hfmd, with the death totally caused by ev71 virus.
【key words】 hand foot and mouth disease; enterovirus infections; virus isolation; child
手足口病(hand, foot and mouth disease,hfmd) 常见于儿童,由肠道病毒71型和柯萨奇病毒a4、a5、a8、a10、a16、b3、b7等引起,其中以肠道病毒71型(enterovirus type 71,ev71)和柯萨奇病毒a16型(coxsackievirus a16,coxa16)为主要病原体，两者均属小rna病毒科肠道病毒属成员。WwW.11665.coM通常情况下,ev71感染引起的手足口病在临床症状等方面与coxa16感染所引起的手足口病难以区别,但ev71感染除了引起hfmd以外,还能够引起无菌性脑膜炎、脑干脑炎和脊髓灰质炎样麻痹等多种与神经系统相关的疾病[1]。广东省于2008年5～6月发生了较为严重的手足口病暴发流行,发病34 107例，发病率36.66/10万。为预防疾病的蔓延,监测手足口病的病原体，现对手足口病进行了早期快速的病原学诊断与分析。
1 材料与方法
1.1 标本的采集与处理 采集2008年广东省疑似手足口病感染者的粪便、肛拭子、咽拭子、疱疹液、脑脊液标本443份,以上标本均由各市带冰上送。标本处理：①粪便：用含10%氯仿的pbs将粪便标本制成悬液,震荡20 min,1 500 g离心30 min,吸上清待检;②肛拭子：在肛拭试管中加入适量的含10%氯仿的pbs，充分震荡，1 500 g离心30 min,吸上清待检;③咽拭子：将含有病毒保存液的咽拭子试管充分震荡，1 500 g离心30 min,吸上清待检;疱疹液、脑脊液无需处理。
1.2 病毒核酸提取及rtpcr 用qiagen公司的rna柱提试剂盒,直接从上述处理好的标本中提取病毒rna,用肠道病毒通用引物、ev71引物、ca16引物进行pcr。
1.3 病毒分离 对凡是肠道病毒通用引物阳性的标本,用人横纹肌肉瘤细胞(rd) 进行病毒分离，待管内细胞长满单层时,每管接种0.2 ml,每份标本接种2管,置于36 ℃、5%的二氧化碳培养箱内培养,每日观察细胞病变(cpe),待cpe达到+ + +以上将培养管置于-20 ℃保存,即为阳性分离株;如果无cpe,则盲传2代,每代连续观察7 d以上,判为阴性株。
1.4 病毒分离株的鉴定 用qiagen公司的rna柱提试剂盒,直接从病毒阳性分离物中提取病毒rna,用肠道病毒通用引物、ev71引物、ca16引物进行rtpcr，以鉴定其型别。
2 结果
2.1 标本定性 所有标本均用rtpcr定性，凡是肠道病毒通用引物阳性的标本再进行病毒分离(图1)。共采集标本443份，肠道病毒通用引物阳性259份，其中粪便159份、肛拭子21份、咽拭子67份、疱疹液10份、脑脊液2份;259份肠道病毒通用引物阳性中，ev71 172份、ca16 26份、ev71+ca16 3份，其余58份为单纯肠道病毒通用引物阳性;从不同病例类型结果可见，死亡病例全部为ev71。见表1、表2。
2.2 病毒分离及鉴定 从肠道病毒通用引物阳性的256份(有3份阳性无标本)标本中进行病毒分离，用rd进行病毒分离，每管接种0.2 ml,每份标本接种2管,置于36 ℃、5%的二氧化碳培养箱内培养,每日观察细胞病变(cpe),待cpe达到+++以上将培养管置于-20 ℃保存,即为阳性分离株;病毒分离的阳性株用rtpcr方法进行鉴定。150份标本分离株分别经3个型引物rtpcr扩增vp1片段,全部都有pcr产物 。结果见表3、4。表1 443份不同类型标本肠道病毒3种引物rtpcr的结果表2 不同病例类型肠道病毒3种引物rtpcr的结果表3 256份不同类型肠道病毒通用引物阳性标本病毒分离及鉴定结果表4 208例不同病例类型肠道病毒通用引物阳性标本病毒分离及鉴定结果
3 讨论
自1974年schmidt等首次报道从美国加利福尼亚爆发表现为神经系统症状疾病的患者中分离到ev71以来,ev71已在世界范围内引起十多次爆发与流行。近年来,ev71的流行在亚太地区呈上升趋势[2],特别是1998年引起台湾地区129 106病例发生,其中405个儿童为重症病例,死亡78例[3],我国的上海、深圳也都报道有手足口病的暴发，并从粪便等标本中分离到ev71型[4，5]，2007年我国的山东、2008年安徽阜阳都有ev71流行的报道。
由于ev71型的感染能引起包括无菌性脑炎、脑膜脑炎、脑干脑炎以及中枢神经系统症状等在内的多种疾病,其中手足口病是ev71型感染所引起最常见的症状之一。儿童感染后易引起严重并发症,病死率高,死亡速度快,造成了社会的不安定。从上述结果可以看出，这次暴发中13例死亡病例全部是ev71型感染，69例重症病例中42例为ev71型，占60.87%。病原不同的手足口病其临床症状可以完全相同,因此病原学诊断非常重要。
从上述结果可以看出，rd细胞对肠道病毒比较敏感，256份标本中，150份病毒分离阳性，阳性率58.59%。从表3可以看出由于粪便标本量大，且肠道病毒多由肠道排出，所以粪便比咽拭子的病毒分离阳性率高;由于肛拭子所采标本量极少，所以分离率明显低于粪便。经统计，粪便、肛拭子、咽拭子、疱疹液、脑脊液之间病毒分离阳性率的比较，差异有统计学意义(χ2=8.704,p<0.05)，这和上海的报道有差异[4]。从不同病例类型的标本病毒分离率来看，死亡、重症、轻症、接触者之间没有差别，差异无统计学意义(χ2=1.04，p>0.05)。对于病毒株的鉴定，肠道病毒的常规病原学诊断是病毒分离培养后进行血清学中和试验定型,由于缺少单价的ev71型和ca16型血清，给鉴定造成一定问题，分子生物学技术的发展克服了以上缺点,rtpcr技术已成为快速诊断肠道病毒的重要手段。这次的监测结果可以说明ev71和coxa16是引起儿童hfmd的主要病原体，由于婴幼儿的抵抗力较差,特别要加强对托幼机构儿童ev71和coxa16的监测,一旦有疫情发生,及时控制隔离传染源,避免疾病爆发流行。
【参考文献】
[1] 金奇. 医学分子病毒学 [m]. 北京:科学出版社, 2001.606.
[2] komatsu k, shimizu y, takeuchi y, et al. outbreak of severe neurologic involvement associated with enterovirus 71 infection [j]. pediatr neurol, 1999,20(1):1723.
[3] lin ty, twu sj, ho ms, et al. enterovirus 71 outbreaks, taiwan: occurrence and recognition [j]. emerg infect dis， 2003,9(3):291293.
[4] 杨智宏，朱启钅容，李秀珠，等. 2002年上海儿童手足口病病例中肠道病毒71型和柯萨奇病毒a组16型的调查 [j]. 中华儿科杂志, 2005,43(9):648652.
[5] 杨洪,何雅青,周丽，等. 深圳市2004年肠道病毒71型和柯萨奇病毒a16型的监测 [j]. 疾病控制杂志， 2006,10(4):389391.
