【摘要】 目的 通过制备抗人类免疫缺陷病毒(hiv) gp120蛋白人源单链可变区抗体（scfv），探索新型抗人获得性免疫缺陷病毒（hiv）治疗方法。方法 采用噬菌体表面展示技术，将hiv-gp120蛋白固相包被于nunc板，应用半合成的人源单链可变区抗体文库技术，从噬菌体单链可变区抗体库中经过5轮吸附-洗脱-扩增筛选过程，随机挑选96个克隆，利用酶联免疫吸附法（elisa）、交叉反应和竞争抑制实验，进行免疫学检测和鉴定，获得与hiv-gp120蛋白结合活性较强的scfv阳性克隆，并对hiv-gp120蛋白scfv的编码基因进行序列测定分析。结果 经过筛选96个克隆中有39株克隆elisa的吸光度（a450 nm）值较高，将这些噬菌体上清与牛血清白蛋白（bsa）进行交叉反应，确定其中有7株交叉反应较弱，结合3次elisa重复实验的a值及竞争抑制实验结果，最后确定1株阳性克隆。提取质粒，进行dna序列测定，dna为699 bp。结论 用噬菌体抗体库技术成功地获得抗hiv-gp120蛋白的scfv，为抗gp120蛋白的scfv防治艾滋病研究创造了条件。
【关键词】 人类免疫缺陷病毒(hiv);gp120;单键可变区抗体（scfv
screening and identification of antibody single chain variable fragment against hiv gp120 jia leili,ma weina,song hongbin,et al.center for disease control and prevention of the people’s liberation army(beijing 100166,china)
abstract： objective to screen single chain variable fragments(scfv) against hivgp120 so as to lay a foundation for developing scfv vaccine againist hiv.methods the recombinant phage antibody library was panned by hivgp120 which was coated in a microwell plate.after five rounds of biopanning,96 clones specific to hivgp120 were determined with enzymelinked immunoabsorbent assay(elisa).the specificity of scfv was identified by elisa and competitive inhibition assay.the dna sequence of the positive clone was determined.results the result showed that scfv had a specific combination character with hivgp120.the dna sequence data showed that the scfv coding gene includding 699 bp.conclusion the results suggested that the scfv fragments to hivgp120 could be successfully selected by recombinant phage antibody library screening technique,which might pave a way for the study of new preventive and therapeutic strategy of aids using anti-gp120 scfv.
key words： hiv;gp120 protein;scfv
人类免疫缺陷病毒（hiv）感染cd4+t细胞是通过壳膜蛋白gp120和细胞表面受体cd4分子之间的相互作用进行，是hiv病毒入侵细胞的第一步。wwW.11665.cOmgp120位于hiv表面，暴露在宿主免疫攻击范围之中〔1〕 。因此，开展hiv-gp120蛋白的抗体研究是探索抗hiv治疗方法的一个重要方向。近年发展起来的噬菌体抗体库筛选技术，可不经人体免疫直接获得人源化抗体，在新一代抗病毒药物设计领域中具有巨大发展潜力。本研究拟采用单链可变区抗体文库的噬菌体表面展示技术，筛选特异性的 hiv-gp120单链可变区抗体。
1 材料与方法
1.1 材料 hiv-gp120蛋白（美国virostat 公司）。人源化噬菌体抗体文库为轻链可变区和重链可变区经甘氨酸接头（gly4ser）3连接的半合成抗体文库〔2〕 。辅助噬菌体m13ko7（北京纽英伦生物技术有限公司）；wizard质粒dna提取纯化试剂盒（美国promega公司）；辣根过氧化物酶（hrp）标记的抗m13噬菌体（hrp/anti-m13）单克隆抗体（美国ge公司）；其他试剂均为国产分析纯。abi 377型自动测序仪（北京博迈德科技发展有限公司）。
1.2 筛选特异性hiv-gp120单链可变区抗体 人源噬菌体抗体文库经过培养和扩增，用辅助噬菌体m13ko7超感染，37 ℃培养过夜，收集上清并用聚乙二醇（peg）浓缩。用hiv-gp120蛋白（20 mg/l）包被nunc培养板，4 ℃过夜，包被液为0.05 mol/l nahco3，ph9.6缓冲液。以牛血清白蛋白（bsa）37 ℃封闭2 h后加入浓缩的噬菌体抗体库，室温90 min，用含有0.05%吐温20（tween 20）/磷酸盐缓冲液（pbs）和pbs各快速洗涤20次，以0.1 mol/ l三乙胺洗脱已吸附在平皿上的噬菌体，然后用1 mol/ l 三羟甲基胺基甲烷（tris）（ph7.4）中和，再感染对数生长期的大肠埃希菌受体菌tg1，培养扩增使表达hiv-gp120蛋白特异性scfv的噬菌粒得到富集。继续重复5次上述吸附-洗脱-扩增过程〔3, 4〕 。
1.3 鉴定gp120蛋白可变区抗体阳性克隆 将最后一轮筛选得到的重组菌涂平皿，从中随机挑选96株单克隆菌株，置于2×ty（氨苄青霉素100mg/l，1%葡萄糖）中，37 ℃培养过夜。经辅助噬菌体m13ko7超感染后，30 ℃培养过夜。上清液用于elisa检测。对筛选得到的阳性克隆重复elisa检测过程。由于在筛选过程中，单克隆抗体溶液中具有bsa组分作为保护剂，因而从理论上来讲有可能筛选到针对bsa特异性的单链可变区抗体。因此，又以bsa作为包被抗原，结合与bsa的交叉反应情况，确定7株与bsa交叉反应较弱的阳性克隆进行竞争抑制实验，最后选定一个阳性克隆提取质粒，进行dna序列测定〔5〕 。
1.4 竞争抑制实验 10 μl噬菌体上清与等体积的以pbs/ bsa 稀释的2 μg/ ml hiv-gp120蛋白混匀，于37 ℃孵育30 min。加入到包被有hiv-gp120蛋白（0.2 μg/ml）的elisa 板中，37 ℃孵育1 h，用含有0.05% tween 20/pbs洗5次，然后加入1∶5 000稀释的 hrp-兔抗m13，37 ℃孵育1 h，m13ko7为阴性对照，四甲基联苯胺（tmb）底物显色〔5〕。
1.5 阳性克隆株dna序列测定 对筛选得到的阳性克隆株按照wizard质粒dna纯化试剂盒方法提取质粒，采用双脱氧末端终止法进行dna序列测定。
2 结 果
2.1 gp120蛋白单链可变区抗体的筛选 单链可变区抗体特异性噬菌粒得到了富集。第1轮产出率（产出率＝捕获的噬菌体数量/投入的噬菌体数量）为1.27×10-4，随着淘洗次数的增加，从固相平板洗脱下来的噬菌粒数显示了增加的趋势，在第5轮筛选后结合到包被hiv-gp120平皿的噬菌体（产出率为1.20×10-2）与第1轮相比，富集了96倍（富集倍数=第5轮产出率/第1轮产出率）。
2.2 hiv-gp120单链可变区抗体的鉴定(图1) 从第5轮筛选后得到的细菌集落中随机挑选96个克隆，用elisa方法测定上清液中含有的hiv-gp120 scfv的结合活性。其中有39株elisa的吸光度（a）值较高。对这些噬菌体抗体进行与bsa的交叉反应试验后，确定其中有7株交叉反应较弱。
图1 阳性克隆的elisa及交叉反应结果
（j02～j72为不同的克隆）
2.3 hiv-gp120 scfv阳性克隆株dna序列测定 对筛选得到的阳性克隆取10μl噬菌体上清进行竞争抑制实验，其中克隆j10株抑制前a450 nm 值为1.582±0.02，抑制后a450 nm值为0.279±0.01，抑制率为82%。对其菌株提取质粒，进行dna序列测定，dna为699bp，符合单链抗体的特征。3 讨 论
艾滋病（aids）是由hiv感染引起的获得性免疫缺陷综合征，hiv主要侵犯宿主的cd4+t细胞以及表达cd4分子的树突状细胞（dc）、单核吞噬细胞（mps）。hiv产生游离的gp120分子，能够发挥特殊的超抗原作用激活体内大量的t细胞，使免疫系统产生病理应答。因此，gp120分子在艾滋病的作用机制中发挥着非常重要的作用，同时也使得其本身成为治疗艾滋病的一个重要靶点。因此，开展hiv-gp120蛋白的抗体研究可能是探索抗hiv治疗方法的一个重要方向。
单链可变区抗体( single-chain variable fragment antibody，scfv) 是具有抗原结合位点的最小抗体片段，由连接肽把抗体重链可变区和轻链可变区连接起来的抗体片段。由于scfv具有分子小、易于穿入组织细胞、没有fc 片段、免疫原性小、能通过基因工程技术大量生产等特点，所以具有较好的应用前景〔6-8〕。近年来，单克隆抗体在抗hiv感染中的应用研究取得了一定进展，但所用单克隆抗体多由杂交瘤生产，用于治疗存在异源蛋白反应等问题〔9〕 。噬菌体抗体库能在体外通过相应筛选而获得特异性人单链抗体，解决了杂交瘤技术不易生产人单链抗体的问题。
以hiv-gp120蛋白为包被固相抗原经5轮筛选后，使结合hiv-gp120的噬菌粒富集了96倍。实验表明，从噬菌体抗体库中筛选出的hiv-gp120 scfv具有较强的结合活性，且该方法具有简便、快速、经济等特点，避免了利用杂交瘤技术制备该抗体周期长、尤其是存在鼠源性蛋白反应的问题。elisa和竞争抑制实验结果表明，筛选得到的hiv-gp120 scfv具有较高的结合活性和较好的特异性。
【参考文献】
1〕 chougnet c,gessani s.role of gp120 in dendritic cell dysfunction in hiv infection［j］.j leukoc biol,2006,80(5):994-1000.
〔2〕 成军，施双双，钟彦伟，等.丙型肝炎病毒核心蛋白可溶性单链可变区抗体在大肠杆菌中的表达［j］.解放军医学杂志,2000,25(6):394.
〔3〕 成军，钟彦伟，施双双，等.hcv非结构蛋白ns5a人源单链抗体可变区基因的筛选与鉴定［j］.中华微生物和免疫学杂志,2000,20(6):567.
〔4〕 钟彦伟,成军,王刚,等.乙肝病毒核心抗原人源单链可变区抗体的筛选［j］.中国公共卫生,2002,18(1):31-32.
〔5〕 jia l,yu j,song h,et al.screening of human antibody fab fragment against hbsag and the construction of its dsfv form［j］.int j biol sci,2008,4(2):103-110.
〔6〕 宋宏彬,唐晓敏,胡小华,等.人源抗hbsag抗体fab段在酵母中的表达［j］.中国公共卫生,2004,20(10):1186-1188.
