【摘要】 目的 探讨季节性流感监测的同时，针对人群中循环的优势毒株开展基因变异分析的意义。方法 以2007年深圳市流感监测系统累积的数据为基础，按周分析不同监测医院流感样病例占门诊和急诊就诊者的比例，并对病毒型别进行常规分离鉴定，对优势毒株扩增ha1区基因片段，并进行基因变异分析。结果 深圳市流感样病例2007年流感样病例(ili)比例为6.67%,以低年龄为高发人群;按市、区医院和社区健康服务中心等分别分析,ili的比例按周分布一致，呈现明显的夏季高峰，最活跃季节在5～7月;ili暴发疫情比散发病例提早2周出现。流感病毒分离率为11.63%,优势株为h3n2亚型(占59.5%)，b型次之(占37.0%)。h3n2亚型流感病毒ha1基因进化分析分成两支，who当年疫苗株和我国代表株仅与1～4月毒株接近，而与5月之后分离株产生了遗传距离，虽然还不能确定新的变异株出现，但提示a/sz/9/2007和a/sz122/2007两个分离株值得高度关注。b型流感病毒ha1基因进化分析发现，2007年以yamagata系最活跃。结论 季节性流感监测中开展病毒分子变异分析，可以进一步查明人群中所发生的优势毒株的特性，便于流行病学综合分析。
【关键词】 流感; 人群监测; 基因; 变异(遗传学)
epidemiological value of molecular variation analysis on seasonal influenza surveillance zhang shunxiang1, gu liniu1，2, cheng xiaowen1, he jianfan1, hu dongsheng2, lv xing1, wu chunli1, lu jianhua1, fang shisong1. 1.shenzhen center for disease control and prevention, shenzhen 518020, china; 2.school of public health, university of zhengzhou, zhengzhou 450001, china
【abstract】 objective to determine the epidemiological value of molecular variation analysis for the predominant strains with the seasonal influenza surveillance. methods percentages of visits for influenzalike illness (%ili) had been analyzed as an indicator of influenza virus activity in the community. nasopharyngeal swabs from the patients with ili were propagated and isolated for viruses. the ha1 region of the predominant viruses were tested by rtpcr and sequenced subsequently. the analyses of pairwise amino acid variations, genetic clustering, and phylogenetics were performed. results total of %ili was 6.67% and there was a summer peak from may to july. total of 50 sporadic outbreaks of influenza were investigated and the peak of the outbreaks preceded the peak of %ili by approximately two weeks. the annually isolating rates of influenza virus was totally 11.63% and fell below the peak of %ili about 4 weeks. the predominant strains included subtype h3n2 (59.5%) and type b (37.0%). phylogenetic clustering analysis of influenza h3n2 virus revealed that there were 2 branches, including the viruses isolated from january to april, and other months of 2007, respectively. the vaccine straines recommended by who and representative strains recommended by ccdc were clustered in branche 1. although some amino acid changes at antigenic sites were found in subtype h3n2 and type b viruses, none of new circulating strains for genetic reassortment or antigenic profiles had been determined. conclusions this has confirmed the epidemiologic significance and value of the molecular variation analysis in seasonal influenza surveillance as an essential public health component for monitoring the incidence and distribution of influenza and predominant strains.
【key words】 influenza; population surveillance; genes; variation (genetics)
当今全球最为关注并投入大量研究的传染病之一当属流感。WWw.11665.cOM世界卫生组织(world health organization,who)每年定期发布流感流行动态和防治标准，推荐疫苗株，推动科学研究和学术交流[1]。疾病预防控制一线的流行病学工作者积极开展流感季节性监测，通常包括流感样病例(influenzalike illness，ili)统计分析和流感病毒的分离鉴定;在国外也将流感相关死亡率和儿童因流感住院情况的报告等纳入监测内容。近几年来，欧美等国家和地区在传统医院和诊所ili报告的同时，探索电话调查[2]、基于互联网[3]、地理信息系统[4]的ili数据收集分析。更为重要的是，他们在季节性监测基础上，开展了流感病毒基因序列测定和分子变异分析，不仅丰富了季节性监测的内容，更显示了流感监测对预防控制工作、尤其是流感暴发和流行应急应对的意义。
2007年，笔者在深圳市流感监测系统(shenzhen influenza surveillance system,siss)季节性常规运转的同时，开展了人群中循环的流感病毒优势毒株的基因序列测定和分析，并对其流行病学意义进行了分析。
1 材料与方法
1.1 流感监测系统运行 按照国家和广东省疾病预防控制中心的要求,建立国家和省级监测点,同时,根据深圳地域和人口等因素,确定市级监测点,各级监测点共同组成siss,按照国家监测方案统一运行。深圳市疾病预防控制中心(szcdc)为网络技术设计单位，对各级监测点人员进行技术培训、质量督导和考核，并定期小结和反馈结果，确保网络良好运行和报告质量。
1.2 ili数据收集和统计 ili参考who定义,规定为发热≥38 ℃，伴咳嗽或咽痛症状，并缺乏其他病原学诊断依据者。由siss中9所监测医院的内科门诊、儿科门诊、急诊科和发热门诊逐日登记, 同时统计上述诊室的就诊病例总数,计算ili占就诊病例数的百分比(percentage of patient visits for ili,%ili)，每周由医院报告szcdc进行汇总,按周%ili作为流感流行的分析指标。
1.3 ili暴发疫情报告 siss将暴发疫情定义为：某人群相对集中的单位如学校、幼托机构、敬老院、工厂或公司、工地等，1周内出现5例及以上ili，由各区疾病预防控制中心接报后调查处理，szcdc按周完成汇总和分析。
1.4 流感病毒分离鉴定和分析 每所流感监测医院从接诊的ili中选取未接受抗病毒治疗的症状期病例采集咽拭子标本，每周10份冷藏运送到szcdc完成病毒分离：按常规方法同时接种狗肾传代细胞和9～11日龄鸡胚，进行流感病毒培养;连续传两代，经血凝实验结果为阳性的标本，采用国家流感中心推荐的标准血清进行血凝抑制实验，完成病毒型别和亚型的鉴定。并将阳性毒株分装后-70 ℃保存，以供日后基因序列测定和分析。计算各年度流感病毒的分离率和逐年各亚型流感病毒的构成比作为分析指标。
1.5 流感病毒血凝素重链区(ha1)基因片段序列测定和分析
1.5.1 病毒粒rna提取 取流感病毒阳性培养液200 μl，采用roche公司商品化试剂盒提取rna，具体操作按说明书进行。
1.5.2 ha1片段的扩增 将提取的流感病毒rna逆转录合成cdna，后用pcr扩增。取6 μl流感病毒rna作为模板，进行反转录。实验所用引物、逆转录酶、rna酶抑制剂、taqdna聚合酶均购自宝生物(大连)有限公司。
1.5.3 序列测定 pcr产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，送宝生物(大连)有限公司进行产物纯化并测序。
1.5.4 核苷酸序列比对和种系发生树分析 与who推荐的年度疫苗株及我国2007年推荐代表株作为参比毒株，同时将测序得到的本地流感病毒株，用simmonic和dnastar软件完成核苷酸同源性和基因进化树分析。其中疫苗株的ha1序列来自flu网，我国代表株ha1序列由国家流感中心提供。
2 结果
2.1 siss的组成 2007年siss由7所疾病预防控制中心(市1所，区6所)、9所医院、3所学校、6个社区健康服务中心和4所禽类饲养和销售市场组成，共有29个单位，覆盖了6个行政区。
2.2 ili按年龄分布 2007年siss共报告ili为151 890例，占就诊病例总数(2 278 884)的比例为6.67%;在所有ili中,0～4岁占47.44%、5～14岁占25.33%、15～24岁占8.40%、25～59岁占17.41%、60岁以上占1.23%，即ili主要集中在0～14岁组儿童和青少年。图1显示了深圳市全部监测点%ili按周分布，虽然各周%ili有所波动，但曲线的总体走势呈单峰型，%ili从第23～24周开始上升，至第27周达到高峰，随后逐步下降，第30～31周回落到一般水平;即 6～7月份为深圳市流感流行期，形成较明显的夏季流行高峰。
2.3 ili按周分布 深圳市2所市级医院中，其中1所综合性医院全年%ili为4.46%(24 428/547 617),而另1所儿童医院的%ili为10.30%(19 774/192 053)，提示低年龄ili较多。图11显示了2所市级医院%ili分布与总体趋势(图14)基本一致。深圳市6个区监测点数据分析提示，市区%ili季节性高峰比市区外明显，平均%ili高于2所市级医院，由图12可见，%ili高峰值也明显超过2所市级医院。图13显示6所社区健康服务中心(简称社康中心)%ili走势与图14一致，但%ili上升和回落更趋缓慢。3所学校%ili高峰明显，与医院监测点报告的%ili相比，峰值高且时间提前到第25～26周。
2.4 ili暴发疫情特点 共报告ili暴发疫情50起，主要分布在15～27周，以24～25周为高峰期，也呈夏季高峰; 但与%ili按周分布(图11)比较，高峰期在24～25周，可能与中小学校ili暴发疫情(共44起，占88.0%)较多有关。见图2。
2.5 各型流感病毒分离结果 2007年流感病毒的分离率分别为11.63%(289/2 484),在分离到的毒株中,h3n2亚型172株,占59.5%,b型毒株107株,占37.0%;而h1n1亚型10株,占3.5%。分离率6～7月最高，1月、8～12月份低于平均水平(表1)。另外，50起暴发疫情中35起(70.0%)检测结果呈阳性，其中a型流感29起，b型6起。
2.6 流感病毒ha1基因进化分析 图3显示，2007年深圳占优势的h3n2亚型流感病毒分离株的演化发展可概括为2个分支，从sz/19/07到sz/101/07共计19株为一个分支，它们绝大多数为2007年1～4月分离，与who连续3个年度即2006/2008和2008/2009的疫苗推荐株以及我国当年的代表株聚集一起，遗传距离接近。而2007年5月以后(主要是5～7月)分离的52株病毒聚集在另一分支，与疫苗株及我国代表株遗传距离较远。
系、26株b(victoria)系毒株ha1区进行测序，选取不同时间、不同地点分离的株b(yamagata)系19株、b(victoria)系7株，构建ha1区基因进化树，与2006年深圳毒株、who疫苗株及我国代表株进行对比(图4)。由图4可见，2007年毒株聚集成2个分支，从sz/3/07到sz/230/07为一个分支，属于b(victoria)系;2006年深圳分离到的大多数毒株，以及2006～2007年疫苗株b/malaysia/2506/2004、国家代表株b/sz/155/2005在一个分支上。而2007年深圳分离的绝大多数毒株即从sz/72/07到sz/320/07共19株构成另一个分支，属b(yamagata)系;与疫苗株b/shanghai/361/2002和b/florida/4/2006距离较远，和国家代表株b/fjxl/54/2006同属一个分支。各分支内部没有发现明显的时间进化差异。
2.7 ha1核苷酸同源性 h3n2亚型流感病毒2007年1～4月分离株与a/jxdh/312/2006的同源性最高，为99.4%～100%;2007年5～12月分离株与2008/2009年度疫苗株(a/brisbane/10/2007)的同源性较高，为98.7%～99.2%。b型流感2007年分离株与b(yamagata)系who疫苗株的同源性为97.1%～97.9%，与国家代表株的同源性为99.0%～99.6%。而在b(victoria)系中，与参照株同源性比较发现，2006年分离株的同源性均高于2007年毒株。
2.8 ha1区氨基酸变异分析 所有h3n2亚型和b型流感毒株ha1基因长度和编码氨基酸均未见缺失或插入，受体结合和二硫键位点氨基酸也显保守。与who推荐的2006/2008年度疫苗株(a/wisconsin/67/2005)对比，2007年h3n2亚型毒株几乎均发生i223v氨基酸替换,其中1～4月分离的毒株发生r142g、n144d氨基酸替换，5月份以后分离的毒株发生g50e、k140i氨基酸替换;2007年分离到的个别毒株还发生了d53n、k158r、r261q和s45n氨基酸置换。上述氨基酸替换的影响是，d122n和s45n氨基酸变异增加一个糖基化位点，而n144d置换导致一个糖基化位点丢失;另外，140、142、144、195位点分别位于抗原决定簇a和b区。虽然按照已知的原则，尚不能判定为新毒株，但 a/sz/9/2007和a/sz122/2007两个分离株值得关注。
b型流感病毒2007年分离株中，b(victoria)系5个糖基化位点均保守;但在b(yamagata)系中，所有分离株发生r48k，大多数发生p108a、l131p、t199i和d197n置换，并由于d197n而增加一个糖基化位点;b/sz320/2007毒株值得重视。
3 讨论
季节性流感监测中不断引入现代流行病学和分子生物学等实验检测技术，是提高常规监测质量的有效手段。siss近3年得到进一步的加强，监测点布局试图满足人口分布和区域相关机构配置需要，技术操作按照我国流感监测方案统一运作，人员技术培训和质量督导等措施确保了监测数据的可靠性和实验室检测的稳定性，先前的研究业已表明这一点[5]。尽管who提出并统一了ili的定义，推动该指标的应用，但在流感监测中，人们更重视病毒的分离培养，ili的报告和分析容易被忽略。以质量控制为前提，以近3年ili数据为基础，2007年笔者开展了人群流感预防控制预警[6]，结合本研究结果，市、区医院和社康中心、学校等ili的走势一致，表明siss积累的数据稳定可信，为进一步探讨与病毒分子变异的关系奠定了基础。
虽然ili不仅由流感病毒引起，也包括其他病原体，但ili可以作为人群流感流行的指标。本研究发现，虽然深圳市2007年全年都有ili活动，但最活跃季节在5～7月;流感病毒分离率最高的月份也在6～7月，表明流感在深圳呈现夏季高峰，符合亚热带地区流感发生和流行特点。由ili的年龄分布和ili暴发特征看，流感急性发病主要累及的人群为儿童和少年，而且在该人群中，流感发生较早。ili比例和趋势在各级医院和社康中心没有太明显的差异，提示现阶段市级医院监测点的设置是必要的。但学校中ili的统计分析可由ili暴发疫情报告代替，因为暴发疫情比散发ili提早2周出现，作为监测指标更敏感。2007年在深圳人群中循环的优势株为h3n2亚型流感病毒(占59.5%)，b型次之占37.0%;而h1n2亚型流感病毒仅占3.5%。2007年2～7月h3n2亚型十分活跃，尤其是4～7月分离率较高;而b型流感病毒中，以yamagata系比较活跃，主要在6～10月份。本研究发现,深圳地区2007年流感病毒分离率为11.63%,以6～7月分离率最高,比ili的高峰期推迟1个月;2007年流感控制的实践证明,ili比病毒分离结果更具有早期预警意义。香港的研究[7]也得到同样的结果，他们发现，流感样病例就诊率与摇摆不定的实验室监测相比，至少可以提前2周发现流感的流行，因此，在香港地区可以作为预测流感流行的指标。
本研究根据流感病毒分离结果所表现的深圳人群中病毒循环映像，进一步被病毒分子变异分析所明确。h3n2亚型流感病毒ha1基因进化分析发现，2007年已分成两支，who当年疫苗株和我国代表株仅与1～4月毒株接近，而与5月之后分离株产生了遗传距离，提示深圳可能是h3n2亚型流感病毒变异较快的地区或城市之一。h3n2亚型流感病毒ha1基因的氨基酸置换分析，虽然还不能确定新的变异株出现，但提示a/sz/9/2007和a/sz122/2007两个分离株值得高度关注。b型流感病毒ha1基因进化分析发现，2007年以yamagata系最活跃，值得重视的毒株为b/sz320/2007。由此可见，病毒分子变异分析，可以进一步查明人群中所发生的优势毒株的特性。流行病学工作者已经也注意到国外的新近研究，特别注意大样本、跨地区、不同年度连续地病毒分子分析结果[8～10]，并且综合地展开分析[11]。我国台湾[12]和香港[7，13]地区业已见诸报道，更由于分子生物学技术的普及，在季节性流感监测中，开展流感分子变异分析的可行性良好。期望国内更多同行跟踪进展，进一步提高季节性流感监测的应用水平。
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