【摘要】 目的 了解经性传播途径高暴露hiv1持续血清阴性者淋巴细胞亚群表达及其免疫活化状态，探讨经性途径高暴露hiv1不易感的免疫基础。方法 收集37例经性传播途径高暴露hiv1持续血清阴性者(简称heps人群)、65例经性传播途径感染hiv1者(简称hiv+人群)、128例健康对照者(简称hc人群)的抗凝全血，用流式细胞仪检测。结果 heps人群和hc人群的cd4绝对数、cd4/cd8比值高于hiv+人群(p<0.001)，而该两类人群的cd8+绝对数则低于hiv+人群(p<0.001);heps人群和hc人群的cd38+/cd4+、hladr+ cd38+/cd4+百分比低于hiv+人群(p<0.001)，同时heps人群的hladr+ cd38+/cd4+百分比低于hc人群(p<0.05);heps人群的hladr+/cd4+百分比低于hiv+人群和hc人群(p<0.001)。结论 heps人群对hiv1的不易感性可能与其t淋巴细胞表面标志活化抗原表达水平处于较低水平状态有关。
【关键词】 hiv1; hiv血清阴性; t淋巴细胞亚群
study on the expression and activation of t lymphocyte subsets in highly exposed hiv1 but persistently seronegative individuals by sexual transmission wang yueyun1,2, wang xiaohui3, cheng jinquan3, peng ji4, chen lin3, shi xiangdong3, nie shaofa1. 1.department of epidemiology and statistics, school of public health, tongji medical college, huazhong university of science and technology, wuhan 430030, china; 2.medical college of yangtze university, jingzhou 434000, china; 3.shenzhen center for disease control and prevention, shenzhen 518020, china; 4.shenzhen municipal chronic disease hospital, shenzhen 518020, china
【abstract】 objective to understand the distribution and immune activation status of t lymphocyte subsets in highly exposed hiv1 and persistently seronegative (heps) individuals, and explore the immunologic mechanism of nonsusceptibility to hiv1 by sexual transmission in heps individuals. methods fresh peripheral venous blood was collected from 37 heps, 65 hiv1infected individuals and 128 healthy controls. four colors flow cytometry was used to detect the distribution of t lymphocyte subsets and expression of hladr, cd38 on cd4+ t cells. results cd4+ counts, cd4/cd8 ratio were higher in heps individuals and healthy controls than those in hiv1infected individuals (p<0.001), but cd8+ counts were significantly lower in the two groups than those in hiv1infected individuals (p<0.001); percentages of cd38+/cd4+, hladr+ cd38+/cd4+ were significantly lower in heps and healthy controls than those in hiv1infected individuals (p<0.001). meanwhile, the percentage of hladr+ cd38+/cd4+ in heps individuals was lower than that in healthy controls (p<0.05). the percentage of hladr+/cd4+ in heps individuals was significantly lower than that in hiv1infected individuals and healthy controls (p<0.001). conclusions the expression of activation antigen marker hladr on cd4+ t cells is at a low level, which probably is correlated with nonsusceptibility to hiv1 in heps individuals by sexual transmission.
【key words】 hiv1; hiv seronegativity; tlymphocyte subsets
我国新发现hiv感染人数呈现明显上升趋势，近几年艾滋病疫情每年以30%左右的幅度增长，阻止艾滋病在我国蔓延的形势十分严峻。WwW.11665.com传染病预防最有效的措施是对人群接种疫苗，但艾滋病疫苗研发虽然投入巨大，短期似乎看不到很大希望，其中一个重要原因就是对hiv对人体免疫系统相互作用的规律等问题缺乏真正意义上的了解[1]。近年来，由于艾滋病疫情控制效果远未达到预期目标，艾滋病疫苗研究亦未取得明显进展，一些学者开始将注意力集中到两类特殊人群，一类人群是较高频率暴露于hiv但未感染，hiv抗体呈阴性反应，该类人群被称为hiv暴露后未感染者(hivexposed seronegative subjects，esns or es人群)[2]或hiv高暴露持续血清阴性者(highly exposed and persistently seronegative, heps人群)[3];另一类人群为感染hiv后长期不进展者(longterm noprogressors,ltnp)。目前，对hiv不易感性的影响因素和机理尚不明确，国内外对heps人群不易感hiv的研究并不多见。
经性接触传播是目前全球主要的hiv1感染传播途径。全球大约70%～80%感染者是通过性接触感染上hiv1,其中异性间性接触传播占70%以上，而男性同性恋性接触传播占5%～10%。近年来，随着我国hiv感染人群由高危人群向普通人群传播的流行趋势的出现，性接触传播hiv起了较重要的影响作用。
人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,hiv)主要侵犯在免疫调节中起重要作用的cd4+ t淋巴细胞，引起其数量减少和功能缺陷，使机体免疫功能低下，导致各种机会感染和肿瘤的发生，最后引发获得性免疫缺陷综合征(aids，艾滋病)[4，5]。
cd8+ t细胞是特异性细胞免疫的效应细胞，通过分泌各种细胞因子，杀死被病毒感染的靶细胞，它是机体抗hiv最主要的免疫细胞，随着hiv病毒量的增加，cd8+ t细胞增加，cd4+ t细胞减少，引起cd4/cd8比例倒置。
人类主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex，mhc)分布在人体所有核细胞的表面，但由于该抗原首先在白细胞表面被发现，故被称为人类白细胞抗原(human leucocyte antigen，hla)，hladr是hlaii类分子的重要抗原之一。正常情况下，hladr仅分布于b细胞、活化的t细胞、巨噬细胞、树突状细胞和精子等[6]。hladr在免疫应答中的主要作用是与t细胞表面的cd4分子和/或抗原结合，促进抗原传递，hladr表达是t细胞活化的标志[7]。
人的cd38分子是分子量为45kd的单链跨膜糖蛋白，胞外决定簇(羧基端)为功能区，是一种多功能酶，在细胞的信号转导中起作用，其细胞外功能区上点突变可抑制信号转导。在成人，cd38蛋白主要表达于大多数的nk细胞、t细胞、b细胞和单核巨噬细胞。cd38分子通过对激活信号的转导，促进t细胞激活，因而，cd38分子可作为细胞活化的标志[8]。
hiv感染者免疫系统活化使得淋巴细胞表面标志活化的抗原表达发生改变，其中hladr的上调即为淋巴细胞活化的主要标志之一[9～11]。hiv1感染导致淋巴细胞活化使外周血t淋巴细胞表面活化标志物hladr、cd38等表达发生改变。其中hladr的增高与t细胞功能缺失相关，且随疾病进展呈线性增高[12]。cd4+ t细胞作为hiv感染的主要靶细胞，其活化性增加为hiv1的复制创造了有利的环境[9]。
本文将选择性传播途径heps人群作为研究对象，选择经性传播途径hiv+人群及无任何高危行为暴露的hc人群作为对照，了解经性传播途径heps人群淋巴细胞亚群表达及其免疫活化状态，探讨经性传播途径高暴露hiv不易感的免疫基础，对识别hiv1感染的高危人群，保护易感者，以及艾滋病的预防控制、临床治疗和疫苗研究等具有重要的理论和现实意义。
1 材料和方法
1.1 研究对象 本文选择的37例经性传播途径高暴露hiv1持续血清阴性者来自于hiv1阳性感染者的配偶或固定性伴，在没有采取安全套保护措施发生性行为达半年以上，每周性行为频率约2～3次及以上，且最后一次无保护性性接触12周后，hiv抗体检测持续阴性，其中男性20例，女性17例，平均年龄(33.1±7.4)岁; hiv1阳性感染者65例，系经性传播途径感染hiv1，其中男性35例，女性30例，平均年龄(31.6±5.6)岁;128例健康对照人群无任何hiv1高危行为暴露史，并排除hiv、hbv、hcv及梅毒感染，其中男性69例，女性59例，平均年龄(30.9±6.2)岁;该三类人群在性别和年龄构成方面差异无统计学意义，组间均衡性较好。三类人群来自于深圳市疾病预防控制中心2006年1月～2007年12月的艾滋病自愿咨询检测人群和常规健康体检人群，均填写知情同意书。
1.2 主要设备及试剂 主要实验设备及试剂均购自becton dickinson公司,包括流式细胞仪(facscalibur);edta抗凝管;鞘液(coulter sheath liquid);cd4绝对计数管;溶血素及下列各种抗体:cd4/cd8/cd3抗体,fitc标记的抗cd4、抗cd8,pe标记的抗cd38单抗及percp标记的抗cd3、apc标记的抗hladr单抗。
1.3 方法 cd4/cd8/cd3绝对值计数，依据1997年美国疾病预防控制中心关于hiv感染者cd4+ t细胞检测指导方法[4]：采用微量全血直接双标记免疫荧光染色，edta(k3)抗凝管收集外周静脉血。加相应的荧光标记抗体各20 μl于50 μl全血中,室温避光孵育15 min。加入红细胞裂解液450 μl,震荡混匀后室温避光孵育15 min直接上机观察，应用bd公司multiset软件检测自动分析。
cd38+/cd4+、hladr+cd38+/cd4+细胞百分比分析：染色、溶血步骤同上，溶血孵育15 min后，800 r/min离心5 min,去上清，加入鞘液2 ml振荡、混匀，800 r/min离心5 min后去上清。加入鞘液500 μl后上机检测。以cd3percp、侧向散射光(ssc)确定t淋巴细胞群，以cd4apc区分出cd4+ t淋巴细胞和cd8+ t淋巴细胞。再以cd38+pe、hladr+apc进行分析。应用bd公司cellquest软件对进行检测与分析。
1.4 统计学处理 cd3、cd4、cd8绝对数直接以均数±标准差表示;cd4/cd8比值、cd38+/cd4+、hladr+cd38+/cd4+等百分比经平方根反正弦变换后以均数±标准差表示,三组人群间均数比较采用方差分析，p<0.05为有统计学意义，所有统计处理采用spss 13.0专业统计软件完成。
2 结果
2.1 不同人群组外周血t淋巴细胞亚群表达的比较 heps人群cd3绝对值计数与hiv+人群和hc人群差异无统计学意义，但hiv+人群cd3绝对值计数低于hc人群;heps人群和hc人群的cd4、cd4/cd8比值均高于hiv+人群，见表1。表1 不同人群组间外周血t淋巴细胞亚群的数量或比值的比较
2.2 不同人群组cd38+/cd4+、hladr+/cd4+、hladr+ cd38+/cd4+细胞百分比(%)比较 heps人群和hc人群的cd38+/cd4+百分比低于hiv+人群，但heps人群和hc人群的cd38+/cd4+百分比差异无统计学意义;heps人群的hladr+/cd4+百分比低于hiv+人群和hc人群;heps人群和hc人群的hladr+ cd38+/cd4+百分比低于hiv+人群，同时heps人群的hladr+ cd38+/cd4+百分比低于hc人群，见表2。表2 不同人群组cd38+/cd4+、hladr+/cd4+、hladr+cd38+/cd4+细胞百分比(%)
3 讨论
本研究结果显示，heps人群和hc人群的cd4+ t细胞、cd4+/cd8+比值均高于hiv+人群(p<0.001)，cd8+ t细胞低于hiv+人群(p<0.001);heps人群和hc人群的cd4+ t细胞、cd8+ t细胞和cd4/cd8比值差异无统计学意义，说明heps人群与hc人群比较，在淋巴细胞亚群表达方面并无特别之处。
heps人群和hc人群的cd38+/cd4+、hladr+/cd4+、hladr+ cd38+/cd4+百分比均低于hiv+人群，机体感染hiv1后，cd4+ t细胞的活化性增加，与有关报道一致[9，10]。heps人群的hladr+/cd4+及hladr+ cd38+/cd4+百分比除了低于hiv+人群外，还低于hc人群,这也许意味着heps人群经性传播途径高暴露hiv1持续血清阴性，是和其hladr+/cd4+、hladr+ cd38+/cd4+的表达处于显著性低水平状态有着密切的联系，进而对hiv1呈现不易感状态。关于heps人群hladr+/cd4+、hladr+ cd38+/cd4+的表达处于显著性低水平状态的原因目前尚不清楚,将有待今后进一步深入研究。
综上所述，本研究中经性传播途径高暴露hiv1持续血清阴性者，即heps人群对hiv1的不易感性可能与其t淋巴细胞表面标志活化抗原表达水平处于较稳定的低水平状态有关。
【参考文献】
[1] koff wc, johnson pr, watkins di, et al. hiv vaccine design: insights from live attenuated siv vaccines [j]. nat immunol， 2006，7(1):1923.
[2] barassi c, lazzarin a, lopalco l. ccr5specific mucosal iga in saliva and genital fluids of hivexposed seronegative subjects [j]. blood， 2004,104(7):22052206.
[3] tang j, shelton b, makhatadze nj, et al. distribution of chenmokine receptor ccr2 and ccr5 genotypes and their relative contribution to human immunodeficiency virus type 1(hiv1) seroconversion, early hiv1 rna concentration in plasm, and later disease progression [j]. j virol, 2002，76(2)：662672.
[4] miedema f, tersmette m, van lier ra. aids pathogenesis: a dynamic interaction between hiv and the immune system [j]. immunol today, 1990,11(8):293297.
[5] 张景祥，徐振源，吴有炜，等. cd4细胞与艾滋病治疗免疫评价的研究 [j]. 疾病控制杂志， 2007，11(4)339341.
[6] benacerraf b. role of mhc gene products in immune regulation [j]. science, 1981,212(4500):12291238.
[7] fauci as, schnittman sm, poli g, et al. immunopathogenic mechanisms in human immunodeficiency virus (hiv) infection [j]. ann intern med, 1991,114(8):678693.
[8] mehta k, shahid u, malavasi f. human cd38, a cellsurface protein with multiple functions [j]. faseb j, 1996,10(12):14081417.
[9] mahalingam m, peakman m, davies et, et al. t cell activation and disease severity in hiv infection [j]. clin exp immunol, 1993,93(3):337343.
[10] ostrowski ma, justement sj, catanzaro a, et al. expression of chemokine receptors cxcr4 and ccr5 in hiv1infected and uninfected individuals [j]. j immunol, 1998,161(6):31953201.
[11] levacher m, hulstaert f, tallet s, et al. the significance of activation markers on cd8 lymphocyles in human immunodeficiency syndrome: staging and prognostic value [j]. clin exp immunol， 1992，90(3)：376382.
