【摘要】 目的 为了探讨hbx基因与肝癌发生的关系，构建hbx基因重组腺病毒载体。方法 应用padeasytm腺病毒载体系统，首先从质粒pcdna3.l-hbx中酶切得到hbx基因，插入腺病毒穿梭质粒padtrack-cmv中，得到padtrack-cmv-hbx，将其pmeⅰ酶切线性化后，转到含腺病毒骨架质粒padeasy-1的bj5183感受态细菌中，通过同源重组得到重组腺病毒质粒载体pad-hbx，经pacⅰ酶切线性化后转染人胚肾293细胞，产生重组腺病毒颗粒ad-hbx。结果 pcr和酶切鉴定证明重组腺病毒ad-hbx构建成功，在转染的293细胞中可以观察到绿色荧光蛋白gfp。结论 成功构建了携带hbx基因的重组腺病毒载体，为后续研究奠定了基础。
【关键词】 乙型肝炎病毒;hbx基因;腺病毒载体
construction of recombinant adenovirus vector carrying hbv x gene
shi zhen, li xiangyang, zhou feng, li jinlong, you hongjuan, tang renxian
(department of microbiology and immunology , xuzhou medical college , xuzhou , jiangsu 221002 , china )
abstract: objective to establish a recombinant adenovirus vector carrying hbx gene so as to explore the relationship between hbx gene and the pathogenesis of hepatocellular carcinoma. methods by using adeasytm adenovirus vector system, a recombined shuttle vector was constructed through the clone of hbx gene into padtrack-cmv,then the vector padtrack-cmv-hbx was linearized using pmeⅰand transformed into bj5183 cell with padeasy-1 to generate recombined adenovirus plasmid pad-hbx through electroporation. subsequently,the plasmid was linearized with pacⅰand transfected into 293 cells to pack into recombined adenovirus ad-hbx. results pcr, dna sequence and restriction endonuclease digestion analysis indicated that the recombined adenovirus vector ad-hbx carrying hbx gene had been successfully constructed. green fluorescent protein (gfp) was observed under the fluorescent microscope.conclusion a recombinant adenovirus vector containing hbx gene was successfully constructed and laid basis for subsequent studies.
key words：hepatitis b virus; hbx gene; adenovirus vector
原发性肝癌(hcc)是常见的恶性肿瘤之一，乙型肝炎病毒(hepatitis b virus,hbv) 感染与hcc的发生密切相关，而hbv x基因编码的hbx蛋白在hbv相关性肝癌发生发展中起关键作用[1]。Www.11665.CoM本实验采用padeasytm重组腺病毒系统，构建hbx基因重组腺病毒载体(ad-hbx)，为进一步研究 hbx 基因对肝癌发展的影响提供可靠的基因转移工具。
1 材料和方法
1.1 材料 真核表达载体质粒pcdna3.l-hbx由本实验室构建并保存[2]， padtrack-cmv腺病毒质粒、含腺病毒骨架质粒padeasy-1的bj5183感受态细菌、人胚肾293细胞株及空白对照腺病毒ad由徐州医学院生物化学与分子生物学研究中心胡书群博士惠赠。pmeⅰ酶、pacⅰ酶购自 neb，其余限制性核酸内切酶及t4dna 连接酶、pcr试剂盒、质粒dna回收纯化试剂盒为美国promega公司产品，effectence转染试剂盒为德国qiagene公司产品。
1.2 方法
1.2.1 padtrack-cmv-hbx重组穿梭质粒的构建 用hindⅲ和ecorⅴ双酶切pcdna3.1-hbx，获取hbx基因，克隆到腺病毒载体padtrack-cmv(同样hindⅲ/ecorⅴ双酶切)中。得到重组腺病毒穿梭质粒padtrack-cmv-hbx。经pcr、酶切验证后送invitrogen(上海)英骏生物技术有限公司测序。
1.2.2 padtrack-cmv-hbx与padeasy的同源重组 将正确重组的穿梭质粒padtrack-cmv-hbx用pmeⅰ酶切线性化，电转化至含腺病毒骨架质粒padeasy-1的感受态bj5183细菌。卡那霉素选择性培养基筛选阳性克隆，挑取最小的克隆扩增培养，提纯质粒。用pacⅰ酶切鉴定质粒，鉴定成功的重组子再次转化感受态dh5α细菌，筛选阳性克隆并提取纯化，得到含hbx基因的重组腺病毒质粒pad-hbx。
1.2.3 重组腺病毒在293细胞内的包装和扩增 经pacⅰ酶切线性化的重组腺病毒质粒pad -hbx转染293细胞，按照effectence转染试剂说明书操作。37℃、5% co2培养箱中孵育，24～48 h后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(gfp)的表达，7～10天后收集包装细胞，反复冻融4次以收获重组腺病毒ad-hbx，将病毒冻融上清液反复感染293细胞以大量扩增并收获病毒。
1.2.4 重组腺病毒ad-hbx目的基因鉴定 5 μl病毒上清液加上10 μl pcr-grade protease k，55℃消化1 h，然后煮沸样品5 min，离心后取1～2 μl进行pcr反应，证实重组腺病毒基因组中含有hbx基因。
2 结 果
2.1 重组腺病毒穿梭质粒padtrack-cmv-hbx的鉴定 用hindⅲ/ecorⅴ酶切后的琼脂糖凝胶电泳图谱以及采用hbx基因全序列的上下游引物其pcr产物的琼脂糖凝胶电泳图谱上都可见一条465 bp的条带，与目的基因hbx的dna片段一致。测序结果也证实重组腺病毒穿梭质粒padtrack-cmv-hbx中hbx的碱基序列与文献报道一致。
2.2 重组腺病毒表达质粒pad-hbx的鉴定 用pmeⅰ酶切线性化padtrack-cmv-hbx与padeasy-1在bj5183细菌中进行同源重组，结果得到重组腺病毒载体质粒pad-hbx。用pacⅰ酶切重组腺病毒表达质粒pad-hbx，0.8%琼脂糖凝胶电泳显示，有30 kb和3.0 kb的2个条带(图1)，证实穿梭质粒和骨架质粒同源重组成功。
2.3 重组腺病毒ad-hbx的包装 含重组腺病毒的质粒pad-hbx转染包装细胞293，在24～48 h后，荧光显微镜下可观察到gfp的表达(图2)，表明重组腺病毒在293细胞中已开始病毒包装。7～10天后可观察到细胞病变(cpe)，大部分包装细胞肿胀脱落。
2.4 重组腺病毒ad-hbx的鉴定 pcr鉴定结果证实重组病毒ad-hbx基因组中含有目的基因，电泳显示465 bp的单一条带(图3)。
3 讨 论
hbx基因编码的x蛋白是一种多功能病毒调节蛋白，具有广泛的基因转录调控作用，并能与宿主细胞的多种蛋白质直接作用，从而调节基因表达及宿主细胞蛋白质功能，进而影响病毒的复制、宿主细胞信号转导、细胞增殖与分化、细胞凋亡及癌变等[3]。
本实验采用限制性内切酶从重组质粒pcdna3.1-hbx得到hbx基因，应用padeasytm重组腺病毒系统在原核细胞大肠杆菌bj5183内进行同源重组[4]， 大大提高了病毒的重组效率。adeasytm重组腺病毒系统中腺病毒骨架质粒含有不完整的腺病毒基因，缺失e1区(1-3533)和e3区。e1区为病毒复制所必需，人胚肾细胞293细胞可以补充e1区。重组穿梭质粒含有目的基因hbx基因、cmv启动子、gfp基因、卡那霉素(kana)耐药基因、限制性内切酶pacⅰ位点和pmeⅰ位点。将穿梭质粒用pmeⅰ酶切线性化后，电转化至含有骨架质粒的感受态细菌bj5183中进行同源重组[5]，利用卡那霉素抗性筛选重组体。重组成功的质粒用pacⅰ线性化，转染293细胞，得到可表达hbx蛋白的重组腺病毒载体。观察其在293细胞中gfp的表达情况，检测hbx蛋白的表达，从而确定重组腺病毒ad-hbx构建成功。本实验构建的携带hbx基因的重组腺病毒载体，具有转染效率高、易检测观察(gfp为报告基因)的优点，为下一步研究hbx对病毒自身的复制与增殖以及宿主细胞中基因的表达与调控、细胞的凋亡与癌变等过程的机制建立基础。
【参考文献】
[1] hwang gy, lin cy, huang lm,et al. detection of the hepatitis b virus x protein (hbx) antigen and anti-hbx antibodies in cases of human hepatocellular carcinoma [j]. j clin microbiol，2003，41(12):5598-5603.
[2] 尤红娟,裴冬生,孙伟,等.乙型肝炎病毒x基因cdna的克隆及真核表达载体的构建[j]. 徐州医学院学报,2006,26(3):191-193.
[3] 汪琼,董俊兴.乙型肝炎病毒x基因及hbx蛋白的研究进展[j].生物技术通讯,2006,17(1):78-80.
[4] zeng m,smith sk,siegel f,et al. adeasy system made easier by selecting the viral backbone plasmid preceding homologous recombination [j]. biotechniques，2001，31(2):260-262.
[5] luo j, deng zl, luo x,et al. a protocol for rapid generation of recombinant adenoviruses using the adeasy system [j]. nat protoc，2007，2(5):1236-1247.
