作者：刘梅，夏鑫华，侴桂新，王峥涛
【摘要】 【目的】建立丹参药材中水溶性成分丹酚酸类和脂溶性成分丹参酮类的超高效液相(uplc)指纹图谱方法，为丹参的质量控制提供快速、科学的方法。【方法】以acquity c18 beh(21 mm×100 mm，17 μm)色谱柱，乙腈(a)体积分数04%甲酸溶液(b)梯度洗脱，90%~50%a，0~10 min;75%a，15 min。检测波长280 nm，柱温30℃，流速05 ml/min。【结果】在15min内得到丹参药材水溶性和脂溶性成分的指纹图谱，峰容量85。并采用液质连用技术(hplcdadesi/msn) 鉴定了其中的20个特征峰。【结论】uplc指纹图谱方法具有灵敏、快速、简便、准确等特点，适合于丹参药材及其制剂的指纹图谱研究和质量控制。
【关键词】 丹参/化学;丹酚酸类/分析;丹参酮类/分析;指纹图谱;色谱法，超高效液相;液质连用
丹参是我国应用最广泛的中药品种之一，临床上有很好的疗效，以丹参作为原料药或君药的单一或复方制剂种类繁多。丹参药材指纹图谱的研究主要集中在分别研究丹参的水溶性成分和脂溶性成分指纹图谱[1-6]，这些方法基本均是将水溶性与脂溶性成分分开，分别建立指纹图谱。wwW.11665.coM作为一种药材中的两大类成分，若能将两者结合起来，在同一张谱图上得到表征，直观地比较其化学成分的差异，将是一项十分有益的工作。目前也有一些报道采用高效液相色谱—二极管阵列检测器(hplcdad)或高效液相色谱—质谱检测器(hplcms)连用的方法建立同时表征丹参药材中水溶性与脂溶性成分的指纹图谱，但是采用hplc 技术，尚难以兼顾和保证两类成分都具有良好的分离度，而且耗时较长。因此，本课题组尝试采用快速色谱技术——超高效液相色谱(uplc)建立丹参的指纹图谱，现报道如下。
1材料与试剂
11实验材料共收集了12个省、市(区)的丹参商品药材13份(表1)。药材经上海中医药大学中药研究所吴立宏博士鉴定为唇形科植物salvia miltiorrhiza bge.的干燥根茎。
12仪器与试药waters acquity uplctm超高效液相色谱仪，包括acquity binary solvent module 二元可选四溶剂高压梯度泵，含在线真空脱气机、acquity sampler module 低扩散自动进样器、acquity tuv detector高速紫外检测器及empower ii色谱管理软件(milford，boston，ma，usa)。milliq system超纯水制备器(millipore，bedford，ma，usa)，kq250db数控超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)，bp211d型电子天平(satorius co.ltd.，德国)。甲醇、乙醇、甲酸均为分析纯(上海国药集团试剂有限公司)，乙腈为色谱纯(merck公司)，超纯水为milliq处理水(millipore co.)。对照品丹参素钠、原儿茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸b、丹酚酸a、二氢丹参酮i、丹参酮i、隐丹参酮和丹参酮iia均由上海中药标准化研究中心提供。
2方法与结果
21 色谱条件与质谱参数
211超高效液相色谱条件 acquity c18 beh(21 mm×100 mm，17 μm)色谱柱，乙腈(a)-体积分数04%甲酸溶液(b)梯度洗脱，90%~50%a，0～10 min;75%a，15 min。检测波长280 nm，柱温30℃，流速05 ml/min，进样量2 μl，运行时间15 min。表1不同产地丹参药材
212超高效液相色谱—质谱连用(lcms)条件 流动相为乙腈(a)—体积分数04%甲酸溶液(b)，洗脱程序与上述条件相同。柱后分流，分流比为1∶50，进样量10 μl，柱温30℃，电喷雾离子源(esi)，源电压-32 kv，负离子模式，雾化气(gas1)：233 pa，帘气(cur)：16 psi，去簇电势(dp)：-20v，聚焦电势(fp)：-80 v，去簇电势2(dp2)：-20 v。质谱扫描质量范围质荷比(m/z)100～800。
22样品溶液和标准品溶液的制备
221样品溶液的制备取丹参粉末05 g(过40目筛)，精密称定，精密加入体积分数10%甲醇20 ml，浸泡30 min后，超声提取30 min，放冷，3 000 r/min离心10 min，取上清液5 ml置25 ml量瓶中。残渣加甲醇20 ml，浸泡30 min后，超声提取60 min，放冷，3 000 r/min离心10 min，取上清液将上述25 ml量瓶补足至刻度，即得。
222标准品溶液的制备取对照品丹参素钠、原儿茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸b、丹酚酸a、二氢丹参酮i、丹参酮i、隐丹参酮、丹参酮iia适量，精密称定，置同一容量瓶中，用甲醇溶解，制成含上述对照品102、126、113、106、137、118、762、100、114、122、119 μg/ml的溶液，作为对照品溶液。
23方法学考察
231精密度实验取同一份供试品溶液，连续进样5次测定，以丹酚酸b为参照峰，分别计算20个特征色谱峰的相对保留时间和相对峰面积sr值，均小于3%。说明仪器精密度良好。
232稳定性实验取同一份供试品溶液，分别于1、3、5、7、9、12、24、48 h进样测定，以丹酚酸b峰为参照峰，分别计算20个特征色谱峰的相对保留时间和相对峰面积sr值，均小于3%，说明样品溶液在48 h内稳定。
233重复性实验同一样品粉末分别精密称取5份，按照上述样品制备方法制成供试品溶液，进样检测。以丹酚酸b峰为参照峰，分别计算色谱中20个特征色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的sr值，均小于3%。说明该方法的重复性良好。
24结果与分析
241丹参高效液相指纹图谱主要色谱峰的lcms鉴定以13个产地丹参药材的共有模式作为丹参药材的指纹图谱(图1)。在该指纹图谱中，20个色谱峰被选为特征峰。通过与对照品比较相对保留时间(tr)，紫外光谱(uv)和液相色谱—质谱联用(lcms)质谱数据(见表2)，结合对照品和文献[7-12]对照，确定了19个色谱峰的归属为1号峰丹参素，2号峰原儿茶醛，3号峰咖啡酸，4号峰丹酚酸d，5号峰丹酚酸g，6号峰丹酚酸e，7号峰丹酚酸c，9号峰迷迭香酸，10号峰紫草酸，11号峰丹酚酸b，12号峰丹酚酸a，13号峰异丹参酮iia，14号峰羟基丹参酮iia，15号峰丹参新醌a，16号峰丹参酮iib，17号峰二氢丹参酮i，18号峰隐丹参酮，19号峰丹参酮i，20号峰丹参酮iia。11号峰(丹酚酸b)既是该指纹图谱中的最强峰，又是有效成分。故以其为参照峰，计算各特征峰的相对保留时间(tr)和相对峰面积(arp)，结果见表3。表2丹参药材中化学成分质谱数据及鉴定表313批不同产地药材中20个特征峰的相对峰面积值
242丹参药材uplc指纹图谱分析采用上述已建立的指纹图谱方法，对13批丹参药材进行指纹图谱分析，得不同产地丹参药材指纹图谱，结果见图2(彩图页第616页)。为了说明丹参药材之间的差异，引入总差异率ptd(%)的概念。差异率的定义是以每个特征指纹峰与相应的标准特征指纹峰的面积归一化值间的差与标准特征指纹峰面积归一化值的比值来表示两者间的差异程度，总差异率则是将每个特征指纹峰的差异率求和即得。计算公式：
ptd=σnias′-ai′as′×n
其中，ptd 为总差异率，as′为标准特征峰面积归一化值，ai′为待比较药材特征峰的面积归一化值，n为特征峰个数。以ptd代表样品图谱与标准图谱之间的相似度，当ptd>1时，表明待测样品与标准样品之间差异较大，说明待测样品有可能非欲鉴定品种。当ptd<1时，值越小说明待测样品与标准样品越相似。
在本实验中，选取13批丹参药材样品的特征峰面积归一化值的平均值作为标准特征峰面积归一化值(表4)，结果显示：(1)这些丹参药材的化学成分的分布具有相似性，每批药材被检测的色谱峰的数目几乎相等。(2)丹酚酸b的色谱峰占非常高的比例，最高达6313%，最低有3598%，说明该化合物是药材中主要成分之一。(3)水溶性成分中，丹参素的含量均较低，脂溶性成分以5个色谱峰为主(平均占总脂溶性成分的80%以上)。(4)就每一个化学成分来说，药材之间的相互差异比较大，13批药材统计处理，所有成分的sr均在20%以上。(5) 根据ptd值来看，13个产地或收集地的丹参药材ptd值均小于1，说明13个样品与标准样品之间的相似度均较高。表4不同产地13批丹参药材指纹图谱共有峰面积归一化值
3讨论
丹参中的两大类化学成分极性差异较大，文献报道显示采用hplc对这两类成分进行指纹图谱分析，通常耗费时间长而且色谱峰之间并不能达到理想的分离度，较难在一张图谱上直观地比较这两种成分之间的差异[1-6]。本课题在大量实验的基础上优选出合适的uplc色谱条件，建立丹参的指纹图谱，只需运行15min就可以将丹参的水溶性与脂溶性成分在同一张色谱图上表征，且色谱峰之间有较好的分离度，达到了高分离度兼顾快速的目的，适合于大量复杂样品的分析。
中药的指纹图谱研究中，hplc法是最常用的分析技术，但是对于一些复杂体系如中药的指纹图谱研究，hplc相对来说也是一种慢速技术，由于中药中所含化学组分多，化学差异较大，为保证目标组分的分离度，需要较长的运行时间，有时也可得到理想的色谱参数如分离度、对称因子和容量因子等。如何在得到理想的色谱参数的情况下，尽可能地缩短分析时间是科研人员比较关注的问题。uplc的色谱柱采用了17μm的小颗粒填料，增加了分析的通量、灵敏度及色谱峰容量，能显著提高分离的效率从而达到缩短分析时间的目的。
本实验中采用了uplc技术建立丹参药材的指纹图谱。结果显示，在15min中内即可获得丹参水溶性成分和脂溶性成分的指纹信息。丹参药材的uplc指纹图谱与hplc指纹图谱比较，色谱峰的个数、整体分布和峰形基本一致，但增加了最难分离物质对的分离度，增加了峰容量，减少了分析时间，说明uplc比hplc的分离能力强。
uplc与hplc具有相同的分离原理，因此uplc色谱条件在hplc条件的基础上稍加优化即可得到理想的色谱图结果。本实验根据上述uplc的色谱条件获得了丹参药材及其制剂的指纹图谱，且与hplc色谱指纹图谱一致的结果，因此，采用uplc 指纹图谱方法具有灵敏、快速、简便、准确等特点，适用于丹参药材及其制剂的指纹图谱研究和质量控制，值得推广和应用。
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