作者：翁阳，陈明净，罗志飞，黄幼生 ,杨丞，丁莉利，徐海霞
【摘要】 目的：探讨胃癌组织中e钙黏连蛋白(ecadherin，ecad)和β连接素(βcatenin，βcat)及cd44v6的表达及其与胃癌发生发展，肿瘤分化、浸润和转移的关系。方法:采用免疫组织化学(sp)法检测70例胃癌、30例癌旁组织、25例慢性萎缩性胃炎和28例胃正常组织中ecad、βcat和cd44v6的表达。结果:胃癌组织中ecad和βcat的表达明显低于慢性萎缩性胃炎、癌旁组织和正常胃黏膜，ecad的阳性表达率与胃癌的浸润深度、淋巴结转移密切相关，与分化程度无关。βcat阳性表达与胃癌的分化程度、浸润深度密切相关，与淋巴结转移无关。胃癌组织中cd44v6蛋白的阳性表达率明显高于慢性萎缩性胃炎、癌旁组织和正常胃黏膜组织，并与胃癌的浸润深度和淋巴结转移密切相关，与分化程度无关。结论:ecad、βcat及cd44v6的表达分别与胃癌的分化、浸润和转移密切相关，同时检测ecad、βcat及cd44v6的表达可作为判断胃癌浸润、转移及预后的良好参考指标。
【关键词】 胃;癌;e钙黏连蛋白;β连接素;cd44v6;免疫组织化学
[abstract] objective: to explore the expression and clinical significance of ecadherin,βcatenin and cd44v6 in occurrence, development, metastasis and differentiation of gastric carcinoma. methods: immunohistochemical staining for ecadherin,βcatenin and cd44v6 were performed to test biopsy specimens of human gastric tissues, including gastric carcinoma (70 cases), paracancer tissue (30 cases), chronic atrophic gastritis tissues (25 cases) and normal gastric tissues (28 cases). results: immunohistochemical study showed that ecadherin,βcatenin and cd44v6 were expressed in gastric cancer tissues with positive rate of 60.0%, 68.6% and 71.4%, respectively. ecadherin expression was significantly correlated with lymph node metastasis and invasion. βcatenin expression was associated with tumor differentiation and invasion. cd44v6 was associated with tumor lymphnode metastasis and invasion. conclusion: ecadherin, βcatenin and cd44v6 expression are associated with invasion, metastasis and differentiation of gastric carcinoma, which are important factors for judging invasion metastasis and differentiation of gastric carcinoma.
[key words] stomach; carcinoma; ecadherin; βcatenin; cd44v6; immunohistochemistry
胃癌浸润转移是其治疗失败导致死亡的主要原因，因此研究浸润转移的机制并对其进行有效防治，对改善患者预后，提高生存率尤为重要。wWw.11665.COm肿瘤的浸润转移必须首先脱离原发灶，黏附在细胞外基质上,然后降解外基质，并通过降解的基质向远处移动。在此过程中，肿瘤细胞表面的黏附分子起着重要作用。e钙黏连蛋白(ecadherin， ecad)和β连接素(βcatenin， βcat)及cd44v6均属于黏附分子家族的成员，本研究采用免疫组织化学方法检测胃癌组织中ecad和βcat及cd44v6的表达，探讨其与胃癌发生发展，分化程度、浸润深度和转移的关系。
1 材料与方法
1.1 材料
收集海南医学院附属医院和海口市人民医院2005年1月～2007年12月手术切除的胃癌标本70例，包括癌旁5 cm处胃组织30例，胃切端正常胃组织28例，伴局部淋巴结转移48例。其中男57例，女13例，年龄34～84岁，平均(61.17±11.97)岁。慢性萎缩性胃炎标本25例。所有标本均经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋。淋巴结通过溶脂法捡取，平均例检出27.8个。所有切片均经he染色观察确诊，并根据who分型，包括管状腺癌55例、粘液腺癌13例、印戒细胞癌2例;高中分化26例，低分化44例。
1.2 免疫组化染色
免疫组化染色采用sp法。所有一抗及试剂盒均购自福州迈新生物技术开发有限公司，一抗稀释比例均为1∶200，染色步骤按试剂盒说明书进行。以胃癌标本手术切端正常胃组织为自身对照，用pbs代替一抗做阴性对照。
1.3 染色结果判断
以细胞膜和/或细胞质和/或胞核出现棕黄或棕褐色颗粒为阳性细胞。免疫组化结果判断参考文献[1]，细胞着色评分：棕褐色为3分，棕黄色为2分，淡黄色为1分，无色或与背景一致淡棕色为0分。阳性细胞比例评分：阳性细胞>75%为4分，51%～75%为3分，11%～50%为2分，≤10%为1分，阴性为0分。最后两者积分相乘：0～3分为(-)，4～6分为(+)，7～9分为(++)，9～12分为(+++)。在结果统计中将(-)和(+)计为阴性，(++)和(+++)计为阳性。
1.4 统计学处理
数据处理采用spss16.0软件进行分析，多组间比较采用 2检验;相关性检验采用spearman相关分析，p<0.05有统计学意义。
2 结果
翁阳等.ecadherin/βcatenin与cd44v6在胃癌中的表达及意义 2.1 ecadherin和βcatenin在胃癌组织、癌旁组织、慢性萎缩性胃炎和正常胃黏膜组织中的表达
ecadherin和βcatenin蛋白在正常胃黏膜、慢性萎缩性胃炎及癌旁组织中主要表达于细胞膜，在肿瘤组织中则主要表现出不同程度的胞质和/或胞核染色,而膜的染色减少(图1～4)。ecadherin在正常胃黏膜和胃癌组织中的阳性表达率分别为89.3%和65.7%，二者之间的差异具有显著性意义(p<0.019)，βcatenin在正常胃黏膜和胃癌组织中的阳性表达率则分别为92.9%和68.8%，二者差异亦具有显著性意义(p<0.019), ecadherin及βcatenin在其他组的表达率与正常胃黏膜的表达率相比有减少但无统计学意义(p>0.019)。见表1、表2。表1 ecadherin在胃癌组织、癌旁组织、慢性萎缩性胃炎和正常胃黏膜中的表达注：与正常胃黏膜组织比较，*p<0.019。表2 βcatenin在胃癌组织、癌旁组织、慢性萎缩性胃炎和正常胃黏膜中的表注：与正常胃黏膜组织比较，*p<0.019。图1 正常胃黏膜ecadherin的正常膜染色(40×4)图3 正常胃黏膜βcatenin的正常膜染色(40×4)图2 胃癌组织ecadherin的膜浆混染或染色减少(40×4)图4 胃癌组织βcatenin的膜染色减少(40×4)2.2 cd44v6在胃癌组织、癌旁组织、慢性萎缩性胃炎和正常胃黏膜中的表达
cd44v6蛋白在胃癌组织、癌旁组织、慢性萎缩性胃炎和正常胃黏膜组织中的阳性表达主要表达于细胞膜，其阳性表达率分别为71.4%、43.3%、60.0%、28.6%，与正常胃黏膜相比，cd44v6在胃癌组织中的表达明显增高，二者差异具有显著性差异(p<0.019)。与癌旁组织相比，cd44v6在胃癌组织中的表达增高亦具有统计学意义(p<0.019)，而在其他组间无统计学意义(p>0.019)。见表3。表3 cd44v6在胃癌组织、癌旁组织、慢性萎缩性胃炎和正常胃黏膜中的表达 注：与正常胃黏膜组织比较*p<0.019; 与癌旁组织比较*p<0.019。
2.3 ecadherin/βcatenin和cd44v6表达与胃癌分化程度、浸润深度及淋巴结转移之间的关系
ecadherin在胃癌组织侵及浆膜层及以外组的阳性表达率明显低于癌组织未侵及浆膜层组，两者比较具有显著性差异(p<0.05)，且在有淋巴结转移组中的阳性表达率低于无淋巴结转移组，两者有显著性差异(p<0.05)，而与分化程度无关。βcatenin阳性表达率与胃癌分化程度及浸润深度相关(p<0.05)，而与淋巴结转移无关。cd44v6阳性表达率与胃癌浸润深度及淋巴结转移明显相关(p<0.05)，而与分化程度无关。见表4。
2.4 ecadherin/βcatenin和 cd44v6在癌组织中表达的相互关系
ecadherin和 cd44v6在癌组织中表达有明显的相关性(r=0.476，p<0.01)。βcatenin与ecadherin及βcatenin与cd44v6的表达在统计学上无相关关系(p>0.05)。表4 ecadherin/βcatenin和 cd44v6表达与分化、浸润和转移之间的关系注：与低分化组比较★p<0.05, 与未侵及浆膜层组比较*p<0.05, 与淋巴结无转移组比较▲p<0.05。
3 讨论
胃癌浸润转移是一个复杂的多因素、多步骤的病理过程。许多研究证明，ecad、βcat和cd44在肿瘤发生浸润转移过程中起着重要作用。ecad是属于钙黏蛋白家族中典型的钙黏蛋白亚族的一员，在所有上皮组织中均表达，主要位于同种上皮细胞膜上的细胞连接处。ecad 正常生理功能的发挥依赖于其与连环素(α、β、γcatenin等)结合形成ecadherincat复合体进而与细胞骨架相连维持细胞间的正常黏附。βcat能与ecad的胞内肽段结合，共同组成细胞黏附复合体。研究发现[2]，不仅是该复合物作用链的重要环节，而且还通过与apc蛋白连接，构成第2种非钙黏蛋白依赖的独立的βcat复合物，并与钙黏蛋白/连环素细胞黏附复合物相互联结，共同介导上皮细胞间的黏附。另外，βcat也是wnt基因家族控制的信号传导路的重要成分，其在表皮生长因子(egf)、肝细胞生长因子(hgf)、cerbb2及src基因等诱导下，发生酪氨酸磷酸化，并迅速影响与之相连的ecad或apc，改变细胞黏附复合物的活性，促进细胞运动及癌细胞的侵袭和转移。黏附分子cd44是分布于细胞表面的一种跨膜糖蛋白，是介导细胞与细胞、细胞与间质之间接触和结合的异类分子，其以配体受体对应的形式发挥作用。cd44v6是cd44的一种拼接变异体，其表达有助于肿瘤细胞获得侵袭和转移潜能。
近来研究发现，ecad在大多数肿瘤组织中相对正常组织显示低表达、异位表达、甚至缺失。本研究结果表明，ecad在胃癌组织中阳性表达率明显低于慢性萎缩性胃炎、癌旁组织及正常胃组织中的表达率，这表明在胃癌形成过程中存在ecad表达下调。各研究对ecad与胃癌浸润转移的报道不一致。yutaka[3]报道ecad低水平表达与胃癌浸润深度及淋巴结转移密切相关，zeyu wu[4]等的研究结果亦显示，ecad低水平表达与淋巴结转移相关，而lazr d[5]等研究结果显示，ecad表达下调与淋巴结转移无关。原因之一可能是淋巴结的捡取方法不一。本研究采取溶脂法捡取淋巴结，较客观地反映淋巴结的转移情况，结果显示ecad低表达与胃癌的浸润深度和淋巴结转移密切相关，提示ecad表达下调、异位表达、甚至缺失，导致细胞间的黏附性下降，从而促使肿瘤细胞的浸润及发生淋巴结转移。有研究报道，βcat胞浆异位是其发生异常的表征，而且与肿瘤的进展有关[6]。 本研究结果显示，βcat在胃癌组织中阳性率低于慢性萎缩性胃炎、癌旁组织及正常胃组织中的表达，且其阳性表达主要位于细胞质和/或胞核，而后三者的阳性表达几乎均在胞膜。另外本研究还发现，βcat低表达与胃癌分化程度及浸润深度密切相关，这与上述文献报告相一致。由此分析，在βcat异位表达使ecadherincat复合体结构受到破坏，导致细胞间黏附能力减弱，细胞活动增强，促进肿瘤细胞的侵袭，或者是wnt信号通路被激活，使细胞大量增殖，促使肿瘤的发生、发展。许多研究[7，8]均证实，cd44v6与肿瘤的浸润转移相关。本研究结果显示，cd44v6在胃癌组织中的表达明显高于慢性萎缩性胃炎及正常胃黏膜组织，cd44v6的表达与胃癌的浸润深度及淋巴结明显相关(p<0.05)，表明cd44v6表达与胃癌的发生密切相关，并在胃癌发展和淋巴结转移过程中起着重要作用。本研究结果还显示，ecadherin和 cd44v6在癌组织中表达有明显的相关性, 提示ecadherin在癌组织中的表达减少和 cd44v6的表达增加在胃癌的发生、发展过程中可能起着反向协同作用。
综上所述，联合检测ecad、βcat、cd44v6的表达对估计胃癌的浸润转移及预后具有重要意义，可作为胃癌生物学行为和预后的良好参考指标。
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