【摘要】 目的：研究脑损伤(tbi)后尼莫同对aqp4表达和血脑屏障(bbb)通透性的影响。方法：健康成年wistar大鼠，自由落体硬膜外撞击方法致重度脑创伤模型，随机分成尼莫同组和生理盐水对照组。每组观察点定为伤后4 h、8 h、12 h、1 d、3 d、5 d和7 d。取大鼠脑组织进行以下实验：(1) he染色进行形态学观察;(2) 免疫组化检测aqp4的表达变化;(3) 测伤区脑组织中eb外渗的量，反映bbb通透性的变化。结果：脑损伤后，在尼莫同组和对照组缺血组织均出现脑损伤的病理改变、aqp4表达上调、bbb通透性增加，其变化趋势一致;且随伤后时间延长改变加重。除aqp4表达外，其他各项指标的差别从tbi 12 h开始具有统计学意义(p<0.05)。结论：脑损伤后，尼莫同可以增加bbb通透性，加重脑损伤，不影响aqp4的表达。
【关键词】 脑损伤;尼莫同;aqp4;血脑屏障;大鼠
[abstract] objective: to explore effect of nimodipine on expression of aqp4 and permeability of blood brain barrier (bbb) after traumatic brain injury. methods: made severe traumatic brain injury mode of wistar rat with epidural impact by free falling. randomly separated all rats into nimodipine group and saline control group. observed rats at 4h, 8h, 12h, 1d, 3d, 5d and 7d after injury respectively. took cerebral tissue for following experiments: (1) morphological observation after he stain; (2) immunohistological experiment for testing expression of aqp4; (3) determination of eb in cerebral injury tissue to observe the permeability of bbb. results: after brain injury, pathological variation, upregulation of aqp4 expression, increase of bbb permeability occurred in ischemic tissue both of nimodipine group and control group. besides, the longer the injury lasted, the more severe these pathological variations were. except expression of aqp4, differences of all indexes were significant between two groups from 12h (p<0.05). conclusion: nimodipine can increase permeability of bbb, and has no effect on expression of aqp4.
[key words] brain injury; nimedipine; aqp4; blood brain barrier; rat
细胞内钙超载在创伤性神经损害中起重要作用。Www.11665.coM脑损伤(tbi)后ca2+浓度升高，激活多种磷酸酶，促使膜磷脂分解，细胞膜及细胞器膜结构均受到损害，膜磷脂降解产物增多，进一步加重细胞功能紊乱。钙超载可以增强ca2+依赖性蛋白酶的活性，促进氧自由基的生成。钙离子拮抗剂能够抑制细胞外ca2+的内流，减少细胞内结合ca2+的释放，阻止胞浆内游离ca2+浓度的升高，减轻神经细胞损伤;使痉挛的血管扩张，改善创伤区的血流和代谢，现在临床上广泛使用的钙离子拮抗剂是尼莫地平[1，2]。为此我们选择在脑损伤后应用钙离子拮抗剂尼莫同(nimotoping)(尼莫地平注射液)，观察尼莫同在脑损伤后对aqp4表达和血脑屏障(bbb)通透性的影响，探讨在脑损伤后应用钙离子拮抗剂对脑的作用。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物和分组 健康wistar大鼠170只，雌雄不限，质量200～280 g，由海南省人民医院动物实验中心提供，符合国家二级实验动物标准。将大鼠随机分为尼莫同组和生理盐水对照组，尼莫同组在tbi后立即腹腔注射尼莫同(2 mg/kg体重)，然后每12 h给药1次。对照组在相应时间点给予相同剂量的生理盐水。每组分为tbi后4 h、8 h、12 h、1 d、3 d、5 d和7 d七个亚组。每个亚组均选取大鼠5只。
1.1.2 主要试剂和仪器 尼莫同：尼莫地平注射液(德国拜尔公司生产)，伊文思兰和甲酰胺(sigma公司)，兔抗鼠aqp4单克隆抗体(santa cruz公司)， sabc法免疫组化试剂盒、dab显色试剂盒(北京中杉公司)。
1.2 实验方法
1.2.1 动物模型的制作 采用改进feeney's[3]自由落体硬膜外撞击方法致局灶性重度脑创伤模型(40 g×25 cm)。so组：除不予以撞击外，其余操作与tbi组相同。于伤后4 h、8 h、12 h、1 d、3 d、5 d和7 d处死动物，留取标本待检测。
1.2.2 免疫组化检测aqp4的表达 在各相应时间点经心脏用4%多聚甲醛(pfa)作预固定，迅速打开颅腔取出完整的大脑，放入4%pfa中后固定24 h。然后常规进行石蜡包埋，作连续5 μm切片。用于he染色形态学观察，并按常规sabc法进行免疫组化检测aqp4的表达。阴性对照：用pbs代替一抗。
1.2.3 eb荧光法测定创伤区脑组织bbb通透性
(1)标准曲线制作：称取4 mg eb于容量瓶中，加生理盐水至总容量为25 ml，取0.3 ml加入5.7 ml甲酰胺中混匀作为第1管;从第1管中取3 ml加入3 ml甲酰胺中作为第2管;将第2管溶液对半稀释作为第3管;依此类推共作6管，其浓度依次为8.0，4.0，2.0，1.0，0.5，0.25 μg/ml，37 ℃水浴卵育48 h后比色(λ=632 nm)，测定光密度，制作标准曲线。
(2)伊文氏蓝(evans blue, eb)含量的测定：各组动物均于处死前1 h注射2%伊文氏蓝3 ml/kg。断头取脑组织，将其放入培养皿中，以防水分蒸发。取损伤区中心脑组织100 mg左右，称重后放入存有3 ml二甲基甲酰胺的试管中，60 ℃水浴中(避光)抽提24 h。1 500 g离心10 min，取上清，应用rf540荧光分光光度计(λ=632 nm)测定eb荧光光度值(od)，蒸馏水作为空白对照。根据光密度数值，从标准曲线上算出脑组织中eb含量，以eb含量(μg/g湿脑组织)代表bbb通透性的改变。
1.2.4 图像分析 光学显微镜下，对免疫组化的切片，选择5个不同视野采用stratagene eagle eey ii型图像分析处理系统进行定量分析。结果以细胞平均光密度值(od)表示。
1.3 统计学处理
数据以均数土标准差(±s)表示，应用spss10.0统计软件进行单因素方差分析和相关分析，p<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 形态学观察
尼莫同组和对照组的病理变化相似。创伤脑组织疏松，空泡样变，细胞间隙增宽，神经细胞胞体皱缩，呈不规则状，神经细胞出现坏死、溶解，胶质细胞增生。自tbi后4 h开始，尼莫同组创伤区病理变化较生理盐水对照组明显。
2.2 aqp4表达的变化
tbi后尼莫同组和对照组aqp4表达的部位和变化趋势基本一致：在海马、视上核、穹窿下器官、最后区、室管膜细胞、脉络从等部位呈阳性表达，胞浆和胞核不着色。但是，图像分析结果显示，脑损伤后不同时间点两组aqp4表达的差异，没有统计学意义，p>0.05。见表1。表1 两组aqp4表达图像分析结果注：尼莫同组与对照组相比，*p>0.05。
2.3 甲酰胺荧光法测定bbb通透性的变化
tbi后两组缺血脑组织中eb含量，均随伤后时间的延长而增加;eb含量增加有两个峰值，分别在tbi 12 h和48 h。在相同时间段，两组eb含量差异具有统计学意义，p<0.05。见表2。表2 两组缺血侧脑组织eb含量的变化注：尼莫同组与对照组相比，*p<0.05。
3 讨论
3.1 尼莫地平与钙超载
电压敏感性ca2+通道(voltagesensitive calcium channels, vsccs)介导的ca2+内流是引起创伤性脑损伤的主要因素之一[4]。根据药理学和电生理学特点，vsccs有l、n、p、q、r和t型等6个亚型[5]。其中l型ca2+通道参与突触后ca2+信号转导，对维持正常脑细胞活性具有重要意义。但在创伤性脑损伤中，ca2+通过l型ca2+通道进入神经元和神经胶质细胞，导致胞浆内ca2+浓度增加——钙超载，参与缺血急性期的脑损害，所以l型ca2+通道对脑具有双重作用[6]。尼莫地平是二氢吡啶类ca2+拮抗剂，具有脂溶性，可以通过血csf屏障。它能阻断神经元的l型ca2+通道，阻止ca2+跨膜向细胞内流，同时可直接刺激神经细胞ca2+atp酶使其活性增高，促使胞浆内ca2+的排除，增强内质网、线粒体等钙库摄取及储存钙的作用，减轻细胞内钙超载。故尼莫地平可以解除血管痉挛，增加脑血流量，广泛应用于重型颅脑损伤的治疗。但目前关于l型ca2+通道阻断剂——尼莫地平对脑的作用，以及它是否可用于治疗脑水肿，尚有争议。
3.2 tbi后尼莫同对aqp4表达和bbb通透性的影响
本实验结果显示，在灌注后才开始应用尼莫同，aqp4的表达变化与生理盐水对照组相似：随再灌注神经延长，其表达逐渐增高，在tbi 48～72 h表达达到高峰，图像分析结果显示，在相同时间段两组aqp4的表达虽有差异，但无统计学意义(p>0.05)。说明尼莫同不能有效抑制或促进aqp4的表达，不能阻断tbi后aqp4参与脑水肿的形成。间接说明tbi后应用钙离子拮抗剂不能抑制或减轻脑损伤脑水肿的形成。这与harris、gaab及devust等学者经动物实验和临床研究得出得结论相一致[79]。同时，我们还发现tbi后尼莫同和生理盐水对照组，脑梗死体积百分比均有随再灌注时间的延长，而逐渐增加的趋势。在tbi后6 h尼莫同组和生理盐水对照组梗死体积百分比无明显差异，自tbi后12 h开始尼莫同组梗死体积百分比明显高于对照组，两组差异增大(p<0.05)。这提示再灌注后即刻应用钙离子拮抗剂，可使脑梗死体积增加，脑损伤加重。
此外，本实验显示，tbi后尼莫同组和对照组大鼠脑组织中eb含量均增加，两组中eb含量的增加均出现2次高峰，而且2个高峰的时间，都在tbi后12 h和tbi后48 h，其中在tbi后48 h的增加比12 h显著，这与kuroiwa[10]等的研究结果相似。但是，应用尼莫同后bbb通透性的开放程度较对照组明显增加;透射电镜下观察到的超微病理变化也显示，应用尼莫同后神经细胞和毛细血管的超微病理变化比生理盐水对照组明显。说明再灌注后即刻应用钙离子拮抗剂加重bbb结构破坏，增加bbb通透性，加重神经细胞和血管损伤。
3.3 创伤性脑损伤后尼莫地平对脑的作用
血管内皮细胞产生的内皮素(endothelin, et)与缺血后bbb通透性增加关系密切，应用内皮素受体拮抗剂可使再灌注后的脑组织含水量下降，evans蓝染色的蛋白质外渗明显减少[11]。脑缺血急性期，血浆中et的水平增高，给予尼莫地平治疗后et的水平虽有下降，但与治疗前相比较没有统计学意义，说明尼莫地平不能拮抗et，不能阻滞缺血后bbb通透性的增加[12]。给脑缺血的大鼠应用尼莫地平，24 h后尼莫地平组和生理盐水对照组的大鼠死亡率没有差别[13],说明尼莫地平不能有效减轻脑缺血后脑损伤。infeld[14]通过对临床脑损伤12 h以内的患者的治疗观察发现，尼莫地平可以引起脑的高灌注，导致更加严重的神经缺失和功能缺损症状。
根据我们的实验结果及结合众多关于尼莫地平在脑缺血中的作用的研究报道，我们认为单纯脑缺血前、后应用尼莫地平可以拮抗ca2+的内流，解除血管痉挛，恢复血流，阻滞bbb通透性的增加，起到脑保护作用;脑损伤后早期应用尼莫地平，则会破坏脑血流的自动调节功能，使bbb结构进一步受到破坏，通透性增加[1618];再灌注造成了生物膜结构的不可逆损伤，给予ca2+拮抗剂后，可以使发生痉挛的血管和结构已经破坏的血管扩张，bbb的结构也进一步破坏，从而使通透性明显增加。血管通透性的增加、血管内液体的外渗引起组织水肿，组织水肿又可导致脑血流减少，减低的脑血流可能降低了尼莫地平在解除血管痉挛中的作用。因此，尼莫地平可能加重再灌注后的高灌流，使微血管内压力升高，进一步增加bbb通透性，加重脑损伤。
总之，脑损伤后应用钙离子拮抗剂可能对脑组织不能起到保护作用。在脑损伤急性期应禁用或慎用钙离子拮抗剂，以免加重脑损伤。通过抑制aqp4表达变化，这可能是临床治疗脑水肿的一种有效途径。还需要进一步研究可以抑制aqp4表达变化的药物。
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