【摘要】 目的: 探讨环磷酰胺(cy)和环孢素a(csa)对sle患者外周血th细胞亚群的免疫调节作用。方法: 以10例重度活动的sle患者和6例正常对照的pbmc为研究对象, 将细胞悬液分为空白组、 植物血凝素(pha)刺激组、 pha+cy组、 pha+csa组、 cy组和csa组分别给药, 体外细胞培养24 h后, 利用三色流式细胞术检测cd4+il10+t细胞、 cd4+ifnγ+t细胞比例和cd8+ il10+ t细胞、 cd8+ifnγ+t细胞等比例, 同时记录相应细胞的荧光强度。结果: csa促进静息和活化状态下pbmc培养中表达cd4+il10+t细胞比例增加, 同时cd4+t细胞表达il10荧光强度增强。cy虽然促进sle pbmc培养中表达cd4+il10+t细胞比例增加, 但对cd4+t细胞表达il10的荧光强度无明显增强。csa抑制pbmc培养中表达cd8+il10+t细胞的比例, 同时cd8+t细胞表达il10的荧光强度减弱。而cy虽然抑制sle pbmc培养中表达cd8+il10+t细胞的比例, 但cd8+t细胞表达il10的荧光强度却是减弱的。csa对活化状态下正常对照和sle pbmc培养中表达cd4+ifnγ+t细胞比例的抑制作用优于cy, 且cy对sle患者pbmc培养中cd4+t细胞表达ifnγ荧光强度抑制作用也是减弱的。csa和cy均可抑制活化状态下, 正常对照pbmc和静息状态下sle pbmc培养中表达cd8+ifnγ+t亚群细胞的比例, 且cy的抑制作用优于csa。wWw.11665.COM但cy对sle pbmc培养中cd8+t细胞表达ifnγ荧光强度的增强作用不如csa。结论: csa和cy均能使cd4+t细胞受抑, cd8+t细胞上升。但csa对t细胞活化, 炎症相关细胞因子表达启动的反应更为敏感, 免疫调节作用更为显著。
【关键词】 环磷酰胺 环孢素a 红斑狼疮 系统性 流式细胞术
sle是一自身免疫性疾病, 其致病机制不仅涉及b细胞、 各种亚群t细胞（th1, th2）及树突状细胞（dendritic cells, dc）, 还涉及复杂的细胞因子网络[1, 2]。目前sle的治疗仍以糖皮质激素（glucocorticoid, gc）及环磷酰胺（cyclophosphamide, cy）等为主, 环孢素a(cyclosporine a, csa)及霉酚酸酯(mycophenolate mofetil, mmf)等新型免疫抑制剂治疗sle及相关疾病亦偶见报导［3］。但对csa、 mmf和cy等免疫抑制剂治疗sle的药理作用具有针对性的实验研究国内外罕见报导[4]。因此, 本研究中以sle患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, pbmc）为研究对象, 探讨csa、 cy两种免疫抑制剂对cd4+和cd8+细胞亚群的作用, 探讨csa、 cy对sle各个重要免疫病理环节的影响, 为临床合理用药提供实验依据。
1 材料和方法
1.1 研究对象 10例活动性sle患者来源于本院风湿科、 肾内科和血液科, 为本院2003-10/2004-08确诊患者, 均符合美国风湿病学会1997年推荐的sle分类标准。6例正常对照来源于健康献血员。除1 例sle患者为男性、 年龄为28岁外, 其余9例均为女性, 年龄13～55(28±6)岁。健康对照者6例, 均为女性, 年龄22～37(30±3)岁。
1.2 试剂 ficoll分离液购自上海华精生物高科技有限公司。cy(1.0 g/支)购自sigma公司（批号091k1176）, 临用前用rpmi1640溶解。csa(5 mg/支)购自sigma公司（批号093k4020）, 临用前用无水乙醇溶解。pha购自广州生物制品公司, 用rpmi1640配成浓度为1 g/l的工作液。藻红蛋白(pe)cy5标记的抗cd4单克隆抗体(mab)(鼠抗人igg1, κ, rpat4克隆); pe标记的抗il10 mab(兔抗人igg1, κ, jes39d7克隆); 异硫氰基荧光素(fitc)标记的抗ifnγ(鼠抗人igg1, κ, 4s.b3克隆); pe标记的小鼠igg1同种型对照免疫球蛋白(mopc21克隆); fitc标记的小鼠igg1同种型对照免疫球蛋白（mopc21克隆); 蛋白质转运抑制剂、 破膜剂及固定剂均购自еbioscience公司。
1.3 方法
1.3.1 pbmc分离培养 采集患者肝素抗凝血10 ml, 轻轻铺于ficoll分离液上(抗凝血与分离液体积比为2∶1), 2300 r/min离心20 min, 吸出中间细胞层（即pbmc）, 用rpmi1640培养液(含100 ml/l胎牛血清, 青霉素100 u/ml, 链霉素100 u/ml)调整细胞密度为1×109/l, 加于24孔培养板中, 每孔1 ml细胞悬液。将细胞悬液分为空白组、 植物血凝素(pha)刺激组、 pha+cy组、 pha+csa组、 cy组和csa组共6组, 在不同组中加入相应试剂, 其中cy至终浓度为160 μmol/l, csa至终浓度为120 μmol/l, pha至终浓度为10 mg/l, 空白组加入相应量的rpmi1640培养液。将细胞置于37℃、 50 ml/l co2培养箱中培养24 h后, 1500 r/min离心5 min, 收集细胞进行流式细胞术检测。
1.3.2 ifnγ阳性和il10阳性细胞亚群检测 应用三色流式细胞仪(epics xl beckmancoulter公司), 根据前向散射光(fs)和侧向散射光(ss)以淋巴细胞群设门, 并对fl1、 fl2和fl3通道设置荧光补偿后, 对cd4+t细胞和cd8+t细胞释放il10和ifnγ的情况进行检测, 同时记录荧光强度。每一样本淋巴细胞门内检测10000个细胞。
1.3.3 统计学分析 sle组与正常对照的不同药物刺激组间差异比较用spss11.5软件进行独立样本t检验; 同一药物处理组内与静息状态比较行配对t检验分析, 同一组内与未用药比较行配对t检验。
2 结果
2.1 csa及cy对sle和正常对照pbmc培养中表达il10的cd4+t细胞和cd8+t细胞亚群比例的影响 与正常对照相比, sle pbmc培养中表达cd4+ il10+t细胞比例均增高, 在pha刺激（即活化状态）下, 其比例进一步增加(表1)。csa和cy均可抑制正常对照和sle患者活化状态下pbmc培养中表达cd4+ il10+t细胞比例增多（p<0.05）。cy抑制正常对照和sle患者pbmc培养中在pha未刺激状态下（静息状态下）表达cd4+ il10+t细胞比例增加的作用优于csa, 相反, csa对活化状态下正常对照和sle患者pbmc培养中表达cd4+ il10+t细胞比例增加的抑制作用优于cy。与正常对照相比, sle pbmc培养中表达cd8+il10+t细胞比例均升高, pha刺激可使其增高（p<0.05）。csa和cy均可抑制活化状态下正常对照pbmc培养中表达cd8+il10+t细胞比例增多, 且csa的抑制作用优于cy。相反, csa和cy均刺激活化状态下sle pbmc培养中表达cd8+ il10+t细胞比例的增加（p<0.05）, 且cy的刺激作用强于csa。cy抑制静息状态下正常对照和sle患者pbmc表达cd8+ il10+t细胞比例增加的作用优于csa。
表1 csa及cy对sle和正常对照pbmc培养中表达il10的t细胞亚群比例的影响（略）
ap<0.05与未经pha刺激组比较; cp<0.05与正常对照相应处理比较; ep<0.05与未用药相应组相比.
（△cd4+ il10+t细胞为cd4+ il10+ifnγ+与cd4+ il10+ ifnγ-之和, cd8+il10+t类推）.
2.2 csa及cy对sle和正常对照pbmc培养中cd4+和cd8+t细胞亚群表达il10荧光强度的影响 与正常对照相比, sle pbmc培养中cd4+t细胞表达il10的荧光强度均增高, pha刺激可使其进一步增加(表2)。csa可促进活化状态下sle和正常对照pbmc培养中cd4+t细胞表达il10的荧光强度的增加（p<0.05）, 而cy则抑制静息状态下sle pbmc培养中cd4+t细胞表达il10的荧光强度的增加（p<0.05）。与正常对照相比, 静息状态下自发分泌项（即空白对照项）和cy的sle pbmc培养中cd8+t细胞表达il10的荧光强度增高, 而csa下降（p<0.05）。pha刺激可使正常对照自发分泌项和cy的pbmc培养中cd8+t细胞表达il10的荧光强度的增加（p<0.05）, 而正常对照的csa和sle的自分泌项、 cy的pbmc培养中cd8+t细胞表达il10的荧光强度却是下降的（p<0.05）。
表2 csa及cy对sle和正常对照pbmc培养中t细胞亚群表达il10荧光强度的影响（略）
ap<0.05与未经pha刺激组比较; cp<0.05与正常对照相应处理比较; ep<0.05与未用药相应组相比.
（△cd4+ il10+t细胞为cd4+ il10+ifnγ+与cd4+ il10+ ifnγ-之和, cd8+il10+t类推）.
2.3 csa及cy对sle和正常对照pbmc培养中表达ifnγ的cd4+t细胞和cd8+t细胞亚群比例的影响 与正常对照相比, sle pbmc培养中表达cd4+ifnγ+t细胞比例有所增高(表3), pha刺激可使其进一步增高（p<0.05）。csa和cy可显著抑制活化状态下sle患者pbmc培养中表达的cd4+ifnγ+t细胞比例的增加。同时csa对活化状态下正常对照和sle pbmc培养中表达的cd4+ifnγ+t细胞比例增加的抑制作用优于cy。与正常对照相比, 在活化状态下sle pbmc培养中表达的cd8+ifnγ+t细胞比例升高, pha刺激可使其增高（p<0.05）。csa和cy可抑制活化状态下, 正常对照pbmc和静息状态下sle pbmc培养中表达cd8+ifnγ+t亚群细胞比例增多, 且cy的抑制作用优于csa。相反, csa和cy均刺激活化状态下sle pbmc培养中表达cd8+ifnγ+t细胞比例的增加（p<0.05）, 且cy的刺激作用强于csa。而在正常对照中cy抑制活化状态下pbmc表达cd8+ifnγ+ t细胞比例作用增加优于csa。
表3 csa及cy对sle pbmc培养中表达ifnγ不同t细胞亚群比例的影响（略）
ap<0.05与未经pha刺激组比较; cp<0.05与正常对照相应处理比较; ep<0.05与未用药相应组相比.
（△cd4+ il10+t细胞为cd4+ il10+ifnγ+与cd4+ il10+ ifnγ-之和, cd8+il10+t类推）.
2.4 csa及cy对sle和正常对照pbmc培养中cd4+t细胞和cd8+t细胞表达ifnγ荧光强度的影响 与正常对照相比, sle pbmc培养中cd4+t细胞表达ifnγ的荧光强度变化不一致(表4)。但pha刺激可使sle和正常对照pbmc培养中cd4+t细胞表达ifnγ的荧光强度进一步增加。csa可促进sle和正常对照pbmc培养中cd4+t细胞表达ifnγ的荧光强度的增加, 而cy则对sle pbmc培养中cd4+t细胞表达ifnγ的荧光强度影响无统计学意义（p>0.05）。与正常对照相比, 静息状态下, sle自发分泌项pbmc培养中cd8+t细胞表达ifnγ荧光强度增高, 而pha刺激项sle pbmc的cd8+t细胞表达ifnγ的荧光强度反而下降。但正常对照pbmc培养中cd8+t细胞表达ifnγ的荧光强度下降无统计学意义。
表4 csa及 cy对sle和正常对照pbmc培养中cd8+t细胞表达ifnγ荧光强度的影响（略）
ap<0.05与未经pha刺激组比较; cp<0.05与正常对照相应处理比较; ep<0.05与未用药相应组相比.
（△cd4+ il10+t细胞为cd4+ il10+ifnγ+与cd4+ il10+ ifnγ-之和, cd8+il10+t类推）.
3 讨论
目前sle的治疗仍以cg为主, 对重症患者加用免疫抑制剂(如cy、 csa或mmf)。cy是一种细胞周期非特异性免疫抑制剂, 主要作用于有大量dna复制的增殖期细胞。csa为钙调磷酸酶拮抗剂, 其作用机制在于抑制t细胞活化核调控因子(nfat)的活化和核转位。因而与cy不同, csa能在t细胞早期活化阶段发挥作用, 抑制t细胞的炎性细胞因子的表达。
本研究中, 在静息和活化状态下, sle pbmc培养表达cd4+il10+t细胞比例增加, 同时cd4+t细胞表达il10的荧光强度增强。csa刺激静息和活化状态下pbmc培养表达cd4+il10+t细胞比例增加, 同时cd4+t细胞表达il10荧光强度增强。cy虽然促进cd4+il10+t细胞比例增加, 但对cd4+t细胞表达il10的荧光强度增加作用不明显。csa抑制表达cd8+il10+t细胞比例, 同时cd8+t细胞表达il10的荧光强度增强。而cy虽抑制表达cd8+il10+t细胞比例, 但cd8+t细胞表达il10的荧光强度减弱。csa和cy可显著抑制活化状态下pbmc培养中表达的cd4+ifnγ+t细胞比例, 同时cd4+t细胞表达ifnγ荧光强度也增高。csa对活化状态下正常对照和sle pbmc培养中表达的cd4+ifnγ+t细胞比例的抑制作用优于cy, 且cy对cd4+t细胞表达ifnγ荧光强度也是减弱的。与之相反, csa和cy可抑制活化状态下, 正常对照pbmc和静息状态下pbmc培养中表达cd8+ifnγ+t亚群细胞比例, 且cy的抑制作用优于csa。但cy对sle pbmc培养中cd8+t细胞表达ifnγ荧光强度的增强作用不如csa。
由此可见, 两药均能干扰sle的免疫紊乱环节, 对炎症相关细胞因子表达异常起到一定的修正作用[1], 但csa能在t细胞早期活化阶段发挥作用, 抑制t细胞的炎性细胞因子的表达, 这可能是csa表现优于cy的原因之一; 另依su等[4]研究报道mmf同样可使sle 患者il10、 ifnγ及il12异常增高的表达水平降低, 并抑制表达il10和表达ifnγ的cd4+t细胞比例, 而地塞米松却使il10表达水平增高, 对ifnγ、 il12无明显影响, 因此推测, csa具有mmf的部分优势, 这是cg及cy所不具备的。
另本研究还观察到一个令人感兴趣的现象, 即csa及cy的应用可使pha刺激下活化的t细胞中表达il10或ifnγ的cd8+t细胞比例明显增高。这可能与cd4+t细胞亚群受到抑制有关。wang等[5]发现sle患者应用cg治疗病情好转, 但其cd8+t细胞增高, 或cd4+t细胞明显下降而cd8+t细胞减少不明显, 甚至出现cd4+/cd8+比例倒置, 这可能与cd8+t细胞的抑制性调节作用有关。即免疫抑制治疗, 有助于抑制cd4+t细胞过度活化引起的异常自身免疫反应, 帮助cd8+t细胞发挥调节作用, 控制cd4+t细胞, 实现病理状态下的免疫稳定。
【参考文献】
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