【摘要】 目的: 构建牛fcγ2r胞外区基因的原核表达载体, 并在e.coli bl21(de3)中表达。方法: 提取健康成年牛的白细胞总rna, 经rtpcr扩增牛fcγ2r胞外区基因片段, 并将其克隆到载体pgemt easy, 经限制性内切酶ecori和 noti双酶切鉴定及序列测定后, 再将其亚克隆入原核表达载体pet28a中, 构建重组质粒pet2r, 转化e.coli bl21(de3)经iptg诱导表达组氨酸融合蛋白。结果: 获得682 bp的编码牛fcγ2r胞外区基因片段。以构建的重组质粒pet2r转化e.coli bl21(de3)后, 经iptg诱导, 表达出相对分子质量(mr)约为30000的重组蛋白。sdspage分析显示, 表达的蛋白主要以不溶性包涵体的形式存在于e.coli bl21(de3)的胞质中, western blot检测表明该蛋白能和牛igg2结合。结论: 成功地构建了原核表达载体pet2r, 并表达出重组蛋白。为研究牛igg和受体的相互作用机制及其介导的免疫反应打下了基础。
【关键词】 牛fcγ2r 胞外区基因 克隆 表达
fc受体(fcr)是一类重要的免疫细胞表面分子, 不仅赋予免疫细胞杀伤病毒与细菌清除免疫复合物、 溶解癌变细胞的能力, 而且参与免疫反应的启动与调节[1]。Www.11665.cOmigfcr按所结合的ig种类可将其分为fcγr、 fcεr、 fcαr、 fcμr和fcδr 5大类, 其中fcγr是fc受体中最重要的1种, 人和小鼠都存在有fcγri、 fcγrⅱ和fcγrⅲ 3个亚类又分别被称为cd64、 cd32和cd16[2]。人们对它们的结构、 功能和生物学特性已有较深入的了解, 已获得fcγrii和fcγriii的晶体结构[3, 4], 并对fcγr与igg的作用位点进行了分析鉴定。牛fcγr的研究比较滞后, 张改平研究小组率先开展了牛fcγr的克隆和鉴定工作, 发现牛fcγr有4种类型: bofcγri、 bofcγrii、 bofcγriii和bofcγ2r, 其中对于bofcγ2r的研究较为全面。1995年zhang等首次发现bofcγ2r 基因, 功能实验表明该受体只特异性亲和牛igg2, 但其与人和小鼠fcγr相距甚远, 而与人类iga fc受体fcαri(cd89)具有较高同源性, 可并不亲和牛和人类iga, 所以代表了一类新型哺乳动物的igg fc受体, 于是根据其配体特异性命名为bofcγ2r, 即牛igg2 fc受体[5]。这一研究结果揭示了反刍动物igg2超级免疫作用的物质基础, 也在一定程度上为解释反刍家畜初乳中不含iga提供了理论依据, 同时引起了一系列同源分子的发现和新的细胞激活途径的发现。2001年morton等[6]证明bofcγ2r的ec1区是亲和igg2fc的特异结构功能区, 2006年zhang等[7]又将bofcγ2r的线性配体结合表位精确定位于ec1区fg loop的4肽区域。这些发现对于探索反刍动物免疫调节的分子机制, 及开发新药和新药靶的研究提供新的思路。为了进一步研究这一新型受体和igg的相互作用机制及其介导的免疫反应, 我们用rtpcr技术扩增了bofcγ2r的胞外环区并在大肠杆菌中进行了表达。
1 材料和方法
1.1 材料 pgemt easy vector systemⅰ、 ez spin column total rna isolation kit、 限制酶ecor i和not i、 t4 dna连接酶购自promega公司; pet28a vector、 e.coli jm109和e.coli bl21(de3)均购自宝生物工程（大连）有限公司; aec(3amino9ethylcarbazole)显色试剂盒为华美生物公司产品。
1.2 方法
1.2.1 引物设计 参照张改平发表的牛fcγ2r的基因（z37506）核苷酸序列利用引物设计软件primer 5.0设计了一对引物: 上游引物b11: 5′ccgggaattcagtgtgggcctaagga3′, 下游引物b12: 5′tttagcggccgcccggatgagattctgc3′, 由大连宝生物生物工程公司合成。为便于基因的克隆及构建表达载体等后续工作, 在引物中引入ecor i、 not i酶切位点。
1.2.2 总rna的提取和rtpcr 从新鲜抗凝牛血中分离牛白细胞, 用ez spin column total rna isolation kit提取总rna, 以b11、 b12为引物, 按照rtpcr试剂盒操作手册对bofcγ2r基因进行rtpcr扩增, 反应体系如下: rnasefree water 23 μl, amv/tf1 5× reaction buffer 10 μl, dntp mix (10 mmoldntp) 1 μl, dowmstream primer 1 μl（50 pmol）, upstream primer 1 μl（50 pmol）, 25 mmol/l mgso4 2 μl, amv reverse transcriptase 1 μl, tf1 dna polymerase 1 μl, rna sample 10 μl, final volume 50 μl。第1链cdna合成参数为48℃反转录45 min。第2链合成时先在94℃预变性2 min, 同时灭活amv反转录酶; 然后进入以下40个循环: 以94℃变性0.5 min, 60℃退火1 min, 68℃延伸2 min; 循环完毕后68℃继续延伸10 min。将rtpcr产物经10 g/l琼脂糖凝胶电泳鉴定, 并回收目的片段。
1.2.3 目的基因的克隆与测序 将回收、 纯化的目的基因片段与pgemt easy载体于16℃连接过夜, 次日转化到jm109感受态细胞中, 提取质粒酶切鉴定和序列测定。
1.2.4 重组表达载体的构建和鉴定 将克隆到t载体上的阳性质粒经ecor i和not i双酶切, 获得的目的片段插入表达载体pet28a相应酶切位点, 重组pet28a转化表达菌bl21（de3）, 挑取单克隆提取质粒进行酶切鉴定, 并命名为pet2r。
1.2.5 重组蛋白的表达 将阳性重组质粒转化bl21(de3)表达宿主菌中, 挑取单菌落, 接种到5 ml lb（含50 mg/l卡那霉素）培养液中37℃振荡过夜培养, 次日以1%的接种量转入5 ml的lb培养液（含50 mg/l卡那霉素）中, 培养至a600=0.6左右时, 加iptg(终浓度为1 mmol/l)进行诱导, 再于37℃培养3～6 h, 4000 r/min离心20 min收集菌体, 用含100 mg/l溶菌酶的pbs重悬菌体, 经超声波裂解后, 4℃ 12000 r/min离心15 min, 分离细胞裂解液上清和沉淀, 以sdspage鉴定表达结果。
1.2.6 western blot检测 iptg诱导的pet2r全菌和未诱导全菌进行120 g/l sdspage后, 将电泳分离的蛋白带电转到pvdf膜, 50 ml/l鸡血清封闭过夜, 将膜放入pbst中洗6次, 每次3 min, 加1∶200倍稀释的辣根过氧化物酶(hrp)标记的牛igg2 37℃孵育2 h, pbst洗膜6次, 每次3 min, aec显色检测目的蛋白。
1.2.7 dot blot分析 在硝酸纤维素膜(millipore)上点印包涵体蛋白(分别以4、 2、 1、 0.5、 0.25 μg量点膜), 以bsa作阴性对照; 自然干燥后, 将印迹膜放入含1 g/l明胶的洗涤液中37℃封闭1 h; 加入以1 g/l明胶稀释的10 mg/l hrp标记牛igg2(hrpigg2)溶液37℃孵育1 h, 以pbst充分洗涤; 用aec (3amino9ethylcarbazole)显色试剂盒参照操作说明进行显色。结果判定时, 以包被包涵体蛋白点呈现棕红色颜色变化, 阴性对照点不出现颜色变化进行判定。
2 结果
2.1 总rna的提取和rtpcr结果 总rna提取以后做rtpcr, rtpcr产物经琼脂糖凝胶电泳检测, 显示出一条682 bp左右的条带（图1）, 与预期大小相符。
2.2 牛fcγ2r胞外区cdna克隆与序列测定 将目的片段和t载体的连接产物转化jm109, 37℃培养过夜后挑取单个菌落, 小量提取质粒后用ecor i、 not i双酶切消化, 经琼脂糖凝胶电泳检测, 可见大小为682 bp左右的片段（图2）, 与预期结果相符, 表明特异片段插入了t载体。测序后, 和已报道的牛fcγ2rcdna序列完全相符。
图1 rtpcr产物的琼脂糖凝胶电泳（略）
m: dna marker; 1: pcr产物.
图2 克隆载体的酶切鉴定（略）
m: dna marker; 1: t2r被ecor i 和 not i双酶切产物.
2.3 重组表达载体的鉴定 重组质粒经ecor i、 not i双酶切鉴定, 在682 bp左右有一特异条带和预期大小相符（图3）。
图3 重组质粒pet2r的酶切鉴定（略）
1:重组质粒pet2r被ecori和noti双酶切;m:dna marker（1000bp）.
2.4 牛fcγ2r胞外区的诱导表达 用pet2r表达质粒转化bl21(de3)宿主菌, 以1 mmol/l iptg诱导表达。诱导菌sdspage电泳结果显示, 诱导3 h后可见mr 30000的重组蛋白, 且表达量基本稳定, 而未诱导的宿主菌以及诱导的pet28a空载体对照菌均未见明显的表达蛋白, 和预期相符（图4a）, 裂解诱导表达菌体, 对表达蛋白进一步分析, 表明大部分表达蛋白存在于裂解菌体的不溶性沉淀中, 而在可溶性裂解菌体溶液中的含量很少, 表明bofcγ2r表达蛋白在菌体内主要以不溶性包涵体形式存在。
2.5 western blot检测 如图4b所示, 重组蛋白在pvdf膜上显示mr 30000的蛋白条带, 而重组质粒诱导前细菌裂解液则没有。
图4 bofcγ2r胞外区的诱导表达及鉴定（略）
a: sdspage; b: western blot. m: 低mr marker蛋白质对照; a1: bl21诱导后产物; a2: pet2r在bl21中诱导后产物; a3: pet2r在bl21中未诱导的产物; b2: pet2r在bl21中诱导后产物; b3: pet2r在bl21中未诱导的产物.
2.6 dot blot检测 以dot blot检测包涵体蛋白与hrpigg2的结合, 结果显示hrpigg2与bofcγ2r包涵体蛋白结合特异性良好（图5）。
图5 bofcγ2r包涵体与牛igg2的结合（略）
a: 4 μg bofcγ2r包涵体蛋白; b: 2 μg bofcγ2r包涵体蛋白; c: 1 μg bofcγ2r包涵体蛋白; d: 0.5 μg bofcγ2r包涵体蛋白; e: 0.25 μg bofcγ2r包涵体蛋白; f: 4 μg bsa.
3 讨论
bofcγ2r主要存在于牛白细胞中, 提取的白细胞质量是本试验的关键。在最初的多次实验中发现, 淋巴细胞分离液不适用于提取牛的白细胞, 后来改用双蒸水裂解法才成功提取出较高质量的白细胞, 为后来高质量总rna的提取及rtpcr的顺利进行奠定了基础。bofcγ2r的cdna由1582个核苷酸组成, 含有单个orf, 计792个核苷酸（264个氨基酸）, 前19个氨基酸为具有明显疏水特征的信号肽, 成熟蛋白起始于第20位的谷氨酸（gln）。胞外区由211个氨基酸组成, 4个半胱氨酸均匀分布, 构成2个ig样闭环(ec1、 ec2), ec1是亲和igg2 fc的特异结构功能区[8]。3个n糖基化位点分布于86126和135位。胞外区之后是19个氨基酸的跨膜区和15个氨基酸的胞质区尾巴。本试验旨在获得bofcγ2r胞外区即ec区的序列, 所以在设计引物时将上下游引物分别放在ec区的两侧即在orf的第14a233a之间共220个氨基酸。
本试验中将编码220个氨基酸的bofcγ2r胞外区基因片段克隆于原核表达载体pet28a, 经过iptg的诱导, 诱导菌体裂解物经sdspage分析有目的蛋白表达。用酶标的牛igg2进行western blot和dot blot检测, 该蛋白在变性条件下能和牛igg2结合, 也是对zhang等[7]证明bofcγ2r有线性配体结合表位的肯定。最重要的是bofcγ2r胞外区在大肠杆菌中的成功表达为研究牛igg和受体的相互作用机制及其介导的免疫反应打下了基础。
【参考文献】
[1] cohensolal jf, cassard l, fridman wh, et al. fcγ receptors[j]. immunol lett, 2004, 92(3): 199-205.
[2] jeffrey v, ravetch, silvia bolland. igg fc receptors[j]. annu rev immunol, 2001, 19: 275-290.
[3] sondermann p, huber r, oosthuizen v, et al. the 3.2a crystal structure of the human igg1 fc fragmentfc gammariii complex[j]. nature, 2000, 406(6793): 267-273.
[4] zhang y, boesen cc, radaev s, et al. crystal structure of the extracellular domain of a human fc gamma riii[j]. immunity, 2000, 13(3): 387-395.
[5] zhang g, young jr, tregaskes cr, et al. identification of a novel class of mammalian fcγ receptor[j]. j immunol, 1995, 155(3): 1534-1541.
[6] morton hc, howard cj, storset ak, et al. identification of residues within the extracellular domain 1 of bovine fcγ2r essential for binding bovine igg2[j]. j biol chem, 2001, 276(51): 47794-47800.
[7] zhang g, guo jq, zhou jy. identification of the linear epitope for fcbinding on the bovine igg2fc receptor (bofcγ2r) using synthetic peptides[j]. febs letters, 2006, 580(2006): 1383-1390.
