【摘要】 目的: 探讨肝硬化患者外周血ip10、 ip10 mrna的表达及其与转氨酶水平的关系。方法: 筛选典型hbv感染后肝硬化患者, 以elisa法检测患者血清ip10水平; realtime pcr检测ip10 mrna含量, 以lg cdna/lg gapdh代表其mrna水平。结果: 肝硬化患者血清ip10及pbmc中ip10 mrna水平分别为(299.3±77.2) ng/l、 0.7479±0.1495, 与对照组相比差异有统计学意义(p<0.05, p<0.01); alt、 ast升高组外周血ip10及其mrna升高, 与转氨酶正常组相比差异有统计学意义(p<0.05, p<0.01)。升高组中 ip10与alt、 ast及alt/ast比值存在相关(r=0.6284, 0.7162, 0.6970, p<0.01)。结论: 肝硬化患者外周血ip10及其mrna表达增高, 与肝细胞损伤程度密切相关, 在介导肝炎后肝硬化进展中起重要作用。
【关键词】 肝硬化 ip 10 mrna pcr 外周血 转氨酶
肝硬化是肝脏纤维结缔组织弥漫性增生伴有肝细胞结节状再生, 是肝细胞在多因素作用下反复损伤的慢性病理过程。ifnγ诱生蛋白10(interferon γinducible protein 10, ip10)是1985年luster等用ifnγ刺激u937细胞株, 从cdna基因库中筛选出, 属cxc家族elr亚族, 可由ifnγ、 lps等诱导产生, 介导th1型炎症反应, 抑制血管新生及肿瘤生长。WwW.11665.cOm丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase, alt)与天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase, ast)及其ast/alt比值能判断肝病进展及肝病预后的较好指标[1]。为了解ip10与血清转氨酶水平关系及其在肝硬化发病机制中的作用, 筛选39例慢性乙肝后肝硬化患者, 探讨其外周血ip10及其mrna水平, 现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 材料 ficollhypaque分离液购自上海试剂二厂; hbvdna诊断试剂购自上海中亚基因研究所; elisa法ip10试剂盒购自法国dlaclone公司; trizol试剂购自美国invitrogen公司; cdna合成试剂购自上海申能博采生物科技有限公司; 半自动生化仪ecomf6124购自德国eppendorf公司; exl808全自动酶标仪和exl50x全自动洗板机购自美国biotek公司; lightcycler faststart dna master sybr greenⅰ购自德国roche公司; icycle荧光实时定量pcr仪购自美国biorad公司。
1.2 检测对象 39例肝硬化患者为2006-01/2007-05我校教学医院收治的患者。其中男27例, 女12例, 年龄31.2～62.5岁, 平均44.5岁, alt升高者18例, ast升高者24例, ast/alt>1.0者27例; 入选患者均为hbv感染者, 临床诊断符合2005年全国病毒性肝炎会议修订诊断标准, 病程均超过6个月, 无合并hav、 hcv、 hdv、 hev、 hiv感染的实验室依据, 无其他自身免疫性疾病, 3个月内未系统使用抗病毒和免疫抑制剂治疗。另选25例本市中心血站体检正常献血员为对照组, 其中男16例, 女9例, 年龄20.3～42.9岁, 平均32.0岁。
1.3 方法
1.3.1 标本采集 分批采取患者晨起空腹静脉血5 ml, 分别置2支含肝素的无菌eppendorf管和2支灭菌普通管。肝素抗凝血以ficollhypaque常规分离外周血单个核细胞(pbmc), 普通管常规分离血清备检。
1.3.2 血清ip10检测 采用elisa以试剂盒提供标准品绘制标准曲线, 每批检测设空白、 阴性、 阳性对照各2孔, 取100 μl待测血清和100 μl辣根过氧化物酶（hrp）标记的抗趋化因子单克隆抗体(mab), 加至包被有趋化因子mab的酶标反应板孔内, 37℃孵育1 h, pbs缓冲液洗涤5次, 加100 μl底物33甲基苯并噻唑啉6磺酸盐, 室温30 min, 加2 mol/l h2so4终止反应, 在exl808全自动酶标分析仪上(450±2) nm处读取a值, 每孔测定2次, 取均值, 依标准曲线确定血清ip10含量。ip10最低检测水平<2 ng/l, 且批内和批间变异系数分别为<5%和<7%。
1.3.3 ip10 mrna检测 采用realtime pcr法。将分离的pbmc以rpmi1640培养液调整细胞数至(1～2)×109个/l悬液; 以trizol试剂抽提pbmc总rna, 并逆转录为cdna, 置-86℃冰箱备检。以sybr greenⅰ荧光标记法检测pcr产物, 总反应体系25 μl, 包括上下游引物各10 pmol, mgcl2 2.5 mmol/l, extaq 1.25 u, dntp 2 mmol/l, 1×pcr buffer (500 mmol/l kcl, 100 mmol/l tris, 20 μg/l gelatin, ph8.3), 2×sybrtm greenⅰ液, 2 μl标准品或模板cdna(1∶5稀释)。趋化因子引物设计参照hirata等方法进行[2, 3], ip10引物序列和扩增片段长度见表1。pcr扩增参数如下: 95℃预变性300 s, 然后95℃ 50 s, 55℃ 40 s, 72℃ 90 s共35个循环, 最后72℃延伸300 s。以甘油醛3磷酸脱氢酶(gapdh)为内对照, 以lg cdna/lg gapdh比值代表其mrna水平。
表1 hbv及ip10引物序列和扩增片段长度（略）
1.3.4 标准品和标准曲线制备 以gapdh为参照标准, 为确定定量扩增的效率和灵敏度, 将起始浓度为(106 copies/μl)的gapdh, 按1∶10设6个梯度浓度, 即106 copies/μl、 105 copies/μl、 104 copies/μl、 103 copies/μl和102 copies/μl、 0。
1.4 统计学处理 ip10及其mrna水平以x±s表示; 采用spss11.5软件进行t检验及相关分析, p<0.05有统计学意义。
2 结果
2.1 不同转氨酶水平患者ip10表达 rtpcr显示肝硬化患者ip10表达(图1), elisa及realtime pcr显示患者外周血ip10及其mrna水平升高(p<0.05或p<0.01, 图2), 依alt、 ast水平将患者分为alt、 ast正常组、 升高组, alt、 ast升高组及ast/alt>1.0组外周血ip10及其mrna水平高于转氨酶正常组, 差异亦有统计学意义(p<0.05或p<0.01, 图2)。
图1 pbmc中ip10表达（略）
1, 3, 5: gapdh; 2, 4, 6: ip10; 1, 2: 对照组; 3, 4: 患者1（转氨酶正常）; 5, 6: 患者2（转氨酶升高）.
图2 ip10及其mrna与转氨酶关系（略）
ap<0.05, bp<0.01 vs 对照组或相应正常组.
2.2 ip10表达与转氨酶水平关系 alt升高组患者血清ip10水平与alt相关(r=0.6284, p<0.01, 图3), ast升高组血清ip10水平与ast明显相关(r=0.7162, p<0.01, 图4), ast/alt比值升高组血清ip10水平与ast/alt比值亦明显相关(r=0.6970, p<0.01, 图5)。
图3 血清ip10水平与alt相关性（略）
图4 血清ip10水平与ast相关性（略）
图5 血清ip10水平与ast/alt相关性（略）
3 讨论
ip10为cxc家族elr-趋化因子, 对表达cxcr3受体的t淋巴细胞、 单核细胞等产生趋化游走。本研究结果显示, hbv感染后肝硬化患者外周血ip10及其mrna水平增高, 与对照组相比, 差异有统计学意义(p<0.01); pbmc内ip10 mrna与血清ip10蛋白水平具有一致性, 提示 pbmc内ip10 mrna可能是导致血清ip10水平升高的重要原因。chuang等[4]研究显示ip10在原发性胆汁性肝硬变患者血浆中明显升高, 且和病情的严重程度相关。赵金红等[5]研究表明ip10在慢性乙肝中表达升高, 介导炎症反应, 参与乙型肝炎慢性化。hbv感染后肝硬化患者体内ip10表达增高可能的原因为: ①肝硬化患者存在一定程度的免疫功能紊乱, 肝清除能力下降, 内毒素生成增加, il1和tnfα生成, tnfα、 il1β、 和ifnγ通过ifn调节因子家族p48和2个stat1形成命名为ifn激活因子3的三聚体, 与ifn刺激元件(isre)结合后, 从而驱动ip10 mrna表达[6]。②肝硬化进程中,随着肝细胞的逐渐坏死, 胶原合成及胶原沉积不断增加, 在肝细胞炎性改变的基础上纤维化程度逐渐加重, 血清ip10水平升高。③肝硬化患者常伴有不同程度的门脉高压、 一定程度胃肠道菌群失调、 肠黏膜缺血缺氧, g-菌及其产物lps等经破损黏膜入血, ip10分泌增加。④肝硬化患者全身高动力循环状态, 门脉高压, ip10可维持血管稳态, 可能作为免疫抑制剂, 发挥潜在的抗肿瘤作用。
本实验结果显示, 肝硬化患者血清ip10含量与alt水平呈正相关, 表明ip10水平在一定程度上反应肝硬化的炎症活动状况, 对了解肝硬化的进展有重要意义。hbv感染的肝细胞损伤主要来自宿主的免疫应答[7], 机体内免疫复合物增加, 刺激机体产生大量tnfα、 il6等前炎症因子, 这些因子本身可诱使肝脏微循环障碍, 血液通透性增加, 全身高动力循环, 肝细胞水肿变性, 继而坏死, alt大量释放入血, ip10表达增强。王健等[8, 9]研究发现在慢性乙肝及丙型肝炎中ip10表达水平升高且和alt表达水平呈正相关, 参与肝炎的慢性化进程。同时血清内ip10含量与ast水平呈正相关。一般情况下, ast升高幅度不及alt, 随着hbv的感染持续, 肝硬化程度加重, 机体内毒素水平升高, 可直接杀伤正常和hbv感染肝细胞, 引起肝细胞黄疸, 血清胆红素升高, 形成肝脏炎症损害, 使ip10活性增加。nishioji等[10]研究表明慢性乙肝中血清ip10水平较正常对照组明显升高, 且和血清转氨酶水平成正相关。ast/alt是反映肝细胞损伤严重程度和评估预后发展的重要指标。本研究结果提示ast/alt>1.0组血清ip10水平明显高于ast/alt≤1.0组。生理情况下ast/alt比值约1.15, 肝细胞受损初期比值先下降, 随着细胞受损加重, 比值呈上升趋势, 肝硬化患者线粒体破坏, ast明显升高, ast/alt>1.0甚至>2.0。ip10对th1型细胞等有较强的趋化作用, 使其聚集到炎症部位, 在清除病毒的同时产生溶酶体酶、 氧自由基等炎性介质加重肝细胞损伤。
综上所述, 在hbv感染后肝硬化患者外周血ip10及其mrna表达水平升高, 与肝细胞损伤程度密切相关, 在清除病毒的同时加重炎症反应, 在肝炎后肝硬化发病机制中起重要作用。
【参考文献】
肝硬化是肝脏纤维结缔组织弥漫性增生伴有肝细胞结节状再生, 是肝细胞在多因素作用下反复损伤的慢性病理过程。ifnγ诱生蛋白10(interferon γinducible protein 10, ip10)是1985年luster等用ifnγ刺激u937细胞株, 从cdna基因库中筛选出, 属cxc家族elr亚族, 可由ifnγ、 lps等诱导产生, 介导th1型炎症反应, 抑制血管新生及肿瘤生长。丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase, alt)与天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase, ast)及其ast/alt比值能判断肝病进展及肝病预后的较好指标[1]。为了解ip10与血清转氨酶水平关系及其在肝硬化发病机制中的作用, 筛选39例慢性乙肝后肝硬化患者, 探讨其外周血ip10及其mrna水平, 现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 材料 ficollhypaque分离液购自上海试剂二厂; hbvdna诊断试剂购自上海中亚基因研究所; elisa法ip10试剂盒购自法国dlaclone公司; trizol试剂购自美国invitrogen公司; cdna合成试剂购自上海申能博采生物科技有限公司; 半自动生化仪ecomf6124购自德国eppendorf公司; exl808全自动酶标仪和exl50x全自动洗板机购自美国biotek公司; lightcycler faststart dna master sybr greenⅰ购自德国roche公司; icycle荧光实时定量pcr仪购自美国biorad公司。
1.2 检测对象 39例肝硬化患者为2006-01/2007-05我校教学医院收治的患者。其中男27例, 女12例, 年龄31.2～62.5岁, 平均44.5岁, alt升高者18例, ast升高者24例, ast/alt>1.0者27例; 入选患者均为hbv感染者, 临床诊断符合2005年全国病毒性肝炎会议修订诊断标准, 病程均超过6个月, 无合并hav、 hcv、 hdv、 hev、 hiv感染的实验室依据, 无其他自身免疫性疾病, 3个月内未系统使用抗病毒和免疫抑制剂治疗。另选25例本市中心血站体检正常献血员为对照组, 其中男16例, 女9例, 年龄20.3～42.9岁, 平均32.0岁。
1.3 方法
1.3.1 标本采集 分批采取患者晨起空腹静脉血5 ml, 分别置2支含肝素的无菌eppendorf管和2支灭菌普通管。肝素抗凝血以ficollhypaque常规分离外周血单个核细胞(pbmc), 普通管常规分离血清备检。
1.3.2 血清ip10检测 采用elisa以试剂盒提供标准品绘制标准曲线, 每批检测设空白、 阴性、 阳性对照各2孔, 取100 μl待测血清和100 μl辣根过氧化物酶（hrp）标记的抗趋化因子单克隆抗体(mab), 加至包被有趋化因子mab的酶标反应板孔内, 37℃孵育1 h, pbs缓冲液洗涤5次, 加100 μl底物33甲基苯并噻唑啉6磺酸盐, 室温30 min, 加2 mol/l h2so4终止反应, 在exl808全自动酶标分析仪上(450±2) nm处读取a值, 每孔测定2次, 取均值, 依标准曲线确定血清ip10含量。ip10最低检测水平<2 ng/l, 且批内和批间变异系数分别为<5%和<7%。
1.3.3 ip10 mrna检测 采用realtime pcr法。将分离的pbmc以rpmi1640培养液调整细胞数至(1～2)×109个/l悬液; 以trizol试剂抽提pbmc总rna, 并逆转录为cdna, 置-86℃冰箱备检。以sybr greenⅰ荧光标记法检测pcr产物, 总反应体系25 μl, 包括上下游引物各10 pmol, mgcl2 2.5 mmol/l, extaq 1.25 u, dntp 2 mmol/l, 1×pcr buffer (500 mmol/l kcl, 100 mmol/l tris, 20 μg/l gelatin, ph8.3), 2×sybrtm greenⅰ液, 2 μl标准品或模板cdna(1∶5稀释)。趋化因子引物设计参照hirata等方法进行[2, 3], ip10引物序列和扩增片段长度见表1。pcr扩增参数如下: 95℃预变性300 s, 然后95℃ 50 s, 55℃ 40 s, 72℃ 90 s共35个循环, 最后72℃延伸300 s。以甘油醛3磷酸脱氢酶(gapdh)为内对照, 以lg cdna/lg gapdh比值代表其mrna水平。
表1 hbv及ip10引物序列和扩增片段长度（略）
1.3.4 标准品和标准曲线制备 以gapdh为参照标准, 为确定定量扩增的效率和灵敏度, 将起始浓度为(106 copies/μl)的gapdh, 按1∶10设6个梯度浓度, 即106 copies/μl、 105 copies/μl、 104 copies/μl、 103 copies/μl和102 copies/μl、 0。
1.4 统计学处理 ip10及其mrna水平以x±s表示; 采用spss11.5软件进行t检验及相关分析, p<0.05有统计学意义。
2 结果
2.1 不同转氨酶水平患者ip10表达 rtpcr显示肝硬化患者ip10表达(图1), elisa及realtime pcr显示患者外周血ip10及其mrna水平升高(p<0.05或p<0.01, 图2), 依alt、 ast水平将患者分为alt、 ast正常组、 升高组, alt、 ast升高组及ast/alt>1.0组外周血ip10及其mrna水平高于转氨酶正常组, 差异亦有统计学意义(p<0.05或p<0.01, 图2)。
图1 pbmc中ip10表达（略）
1, 3, 5: gapdh; 2, 4, 6: ip10; 1, 2: 对照组; 3, 4: 患者1（转氨酶正常）; 5, 6: 患者2（转氨酶升高）.
图2 ip10及其mrna与转氨酶关系（略）
ap<0.05, bp<0.01 vs 对照组或相应正常组.
2.2 ip10表达与转氨酶水平关系 alt升高组患者血清ip10水平与alt相关(r=0.6284, p<0.01, 图3), ast升高组血清ip10水平与ast明显相关(r=0.7162, p<0.01, 图4), ast/alt比值升高组血清ip10水平与ast/alt比值亦明显相关(r=0.6970, p<0.01, 图5)。
图3 血清ip10水平与alt相关性（略）
图4 血清ip10水平与ast相关性（略）
图5 血清ip10水平与ast/alt相关性（略）
3 讨论
ip10为cxc家族elr-趋化因子, 对表达cxcr3受体的t淋巴细胞、 单核细胞等产生趋化游走。本研究结果显示, hbv感染后肝硬化患者外周血ip10及其mrna水平增高, 与对照组相比, 差异有统计学意义(p<0.01); pbmc内ip10 mrna与血清ip10蛋白水平具有一致性, 提示 pbmc内ip10 mrna可能是导致血清ip10水平升高的重要原因。chuang等[4]研究显示ip10在原发性胆汁性肝硬变患者血浆中明显升高, 且和病情的严重程度相关。赵金红等[5]研究表明ip10在慢性乙肝中表达升高, 介导炎症反应, 参与乙型肝炎慢性化。hbv感染后肝硬化患者体内ip10表达增高可能的原因为: ①肝硬化患者存在一定程度的免疫功能紊乱, 肝清除能力下降, 内毒素生成增加, il1和tnfα生成, tnfα、 il1β、 和ifnγ通过ifn调节因子家族p48和2个stat1形成命名为ifn激活因子3的三聚体, 与ifn刺激元件(isre)结合后, 从而驱动ip10 mrna表达[6]。②肝硬化进程中,随着肝细胞的逐渐坏死, 胶原合成及胶原沉积不断增加, 在肝细胞炎性改变的基础上纤维化程度逐渐加重, 血清ip10水平升高。③肝硬化患者常伴有不同程度的门脉高压、 一定程度胃肠道菌群失调、 肠黏膜缺血缺氧, g-菌及其产物lps等经破损黏膜入血, ip10分泌增加。④肝硬化患者全身高动力循环状态, 门脉高压, ip10可维持血管稳态, 可能作为免疫抑制剂, 发挥潜在的抗肿瘤作用。
本实验结果显示, 肝硬化患者血清ip10含量与alt水平呈正相关, 表明ip10水平在一定程度上反应肝硬化的炎症活动状况, 对了解肝硬化的进展有重要意义。hbv感染的肝细胞损伤主要来自宿主的免疫应答[7], 机体内免疫复合物增加, 刺激机体产生大量tnfα、 il6等前炎症因子, 这些因子本身可诱使肝脏微循环障碍, 血液通透性增加, 全身高动力循环, 肝细胞水肿变性, 继而坏死, alt大量释放入血, ip10表达增强。王健等[8, 9]研究发现在慢性乙肝及丙型肝炎中ip10表达水平升高且和alt表达水平呈正相关, 参与肝炎的慢性化进程。同时血清内ip10含量与ast水平呈正相关。一般情况下, ast升高幅度不及alt, 随着hbv的感染持续, 肝硬化程度加重, 机体内毒素水平升高, 可直接杀伤正常和hbv感染肝细胞, 引起肝细胞黄疸, 血清胆红素升高, 形成肝脏炎症损害, 使ip10活性增加。nishioji等[10]研究表明慢性乙肝中血清ip10水平较正常对照组明显升高, 且和血清转氨酶水平成正相关。ast/alt是反映肝细胞损伤严重程度和评估预后发展的重要指标。本研究结果提示ast/alt>1.0组血清ip10水平明显高于ast/alt≤1.0组。生理情况下ast/alt比值约1.15, 肝细胞受损初期比值先下降, 随着细胞受损加重, 比值呈上升趋势, 肝硬化患者线粒体破坏, ast明显升高, ast/alt>1.0甚至>2.0。ip10对th1型细胞等有较强的趋化作用, 使其聚集到炎症部位, 在清除病毒的同时产生溶酶体酶、 氧自由基等炎性介质加重肝细胞损伤。
综上所述, 在hbv感染后肝硬化患者外周血ip10及其mrna表达水平升高, 与肝细胞损伤程度密切相关, 在清除病毒的同时加重炎症反应, 在肝炎后肝硬化发病机制中起重要作用。
