作者：何彦丽,杜标炎,王慧锋,苏宁,肖霞
【摘要】 【目的】观察枸杞多糖(lbp)对实验性肝癌小鼠肿瘤细胞死亡分子fas配体(fasl)表达的影响,探讨其抗肿瘤作用机制。【方法】选用昆明种小鼠,随机分为模型组,lbp低、高剂量组(剂量分别为0625、1250 g·kg-1·d-1),各组均采用右侧腋下接种h22肝癌腹水型细胞复制荷瘤模型,从第3天开始按设计剂量给药,连续14 d。采用苏木素—伊红(he)染色观察各组肿瘤细胞密度、细胞核分裂计数及间质淋巴细胞浸润情况，采用免疫组化法观察各组小鼠肿瘤细胞fasl表达情况。【结果】 lbp低、高剂量组均可显著降低肿瘤细胞核分裂计数(p＜005)；lbp高剂量组可升高肿瘤间质淋巴细胞浸润程度(p＜005),he染色显示在肿瘤边缘组织内见多量淋巴细胞浸润。lbp低、高剂量组均可显著降低小鼠肿瘤细胞fasl阳性表达指数(p＜005)；免疫组化染色显示模型组fasl表达强阳性,lbp低剂量组部分肝癌细胞内fasl表达阳性,fasl仅在lbp高剂量组少量肝癌细胞中有表达。【结论】 lbp抗实验性肝癌的效应可能与其能抑制fasl表达,减少免疫活性细胞凋亡有关。Www.11665.COM
【关键词】 枸杞多糖/药理学 肝肿瘤/中药疗法 肿瘤组织/病理学 基因表达调控 疾病模型,动物 小鼠
abstract: objectiveto observe the influence of lycium barbarum polysaccharide(lbp) on fasl expression in h22bearing mice and to explore its antitumor mechanism. methodskunming mice were randomized into the model group, and low and highdose lbp (in the dose of 0625 and 1250 g·kg-1·d-1 respectively) groups. h22bearing mice models were induced through right subaxillary inoculation of h22ascitic cells. three days after inoculation, lbp group were given lbp for 14 days. hematoxylin and eosin(he) staining method was used to examine the tumor cell density, tumor cell mitotic count, and lymphocyte infiltration in tumor interstitial tissue. fasl expression was observed in the three groups with immunohistochemical method. resultstumor cell mitotic count was decreased in the two lbp groups (p<005), the score of lymphocyte infiltration in tumor interstitial tissue was increased,and lymphocyte infiltration was obvious after he staining in highdose lbp group (p<005). the index of fasl expression positive was decreased in both lbp groups (p<005).fasl expression was strong positive in the model group, and positive in partial liver tumor cells of lowdose lbp group and in less liver tumor cells of highdose lbp group. conclusionthe antitumor mechanism of lbp is probably related with the inhibition of fasl expression and with the suppression of apoptosis of immune active lymphocytes．
key words:lycium barbarum polysaccharide/pharmacology;liver neoplasms/tcd therapy;neoplasms /pathology;gene expression regulation;disease models, animal;mice
死亡分子fas(apo1/cd95)和其配体fasl相互作用是细胞凋亡的重要途径之一。肿瘤细胞可通过表达fasl,与活化的fas(+)的淋巴细胞接触,主动杀伤免疫活性细胞,实现其免疫逃逸,故又称为fas反击［1-2］。研究证实枸杞多糖(lbp)具有广泛的抗肿瘤效应［3-4］,本研究通过观察小鼠实验性肝癌组织fasl表达情况及病理学改变,探讨lbp抗实验性肝癌作用可能存在的机制和靶点。现报道如下。
1 材料与方法
1.1 动物与瘤株昆明种小鼠,清洁级,6～8周龄,体质量(18±2)g,雌雄各半,由广州中医药大学实验动物中心提供,合格证号：0002769；h22肝癌腹水型细胞株由中山大学医学院实验动物中心细胞库提供。
1.2 药物与试剂枸杞多糖(lycium barbarum polysaccharide,lbp)由广州中医药大学热带医学研究所药物化学研究室从优质宁夏枸杞子中分离提取,采用双光束紫外可见分光光度计测定lbp含量为358 g/kg；兔抗fasl免疫组化试剂为boster biotechnology公司产品,批号：ba0049；兔多克隆抗体免疫组织化学染色试剂盒(sa1022)、二氨基联苯胺(3,3′diaminobenzidine,dab)显色试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司；甲醛、乙醇、二甲苯均为汕头市光华化学厂产品；石蜡为江苏太仓皓天石蜡厂产品。
1.3 仪器tu1901双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；libror aeg220电子天平(日本岛津)；nex power 1000型纯水器(韩国human corp)；to1020脱水机、eg1160包埋机、rm2135轮转切片机、st4040染色机均购自德国leica公司；cx21显微镜(日本olympus)。
1.4 分组造模及给药昆明种小鼠45只,随机分为3组,每组15只,分别为模型组及lbp低、高剂量组,均于第1天采用右侧腋下接种2×106个h22肝癌腹水型细胞复制荷瘤模型。从第3天开始,模型组以05 ml/d生理盐水灌胃,lbp低、高剂量组分别给予lbp 0625、 1250 g·kg·d-1灌胃,连续14 d。枸杞多糖给药剂量根据参考文献［5］结合预试验结果而设定。
1.5 观察指标
1.5.1 肿瘤组织病理学检查每天观察小鼠的毛发、营养、体质量、精神状况、肿瘤生长及死亡等情况。第15天小鼠脱颈椎处死,肿瘤组织按组排列拍照后,肉眼观察肿瘤大小、颜色、坏死情况等,切取部分组织用体积分数10%中性甲醛固定,常规石蜡包埋,苏木素—伊红(he)染色,光学显微镜下对各组肿瘤细胞密度、细胞核分裂像计数及对间质淋巴细胞浸润情况进行半定量分析,由经验丰富的病理医师采用双盲法进行评分、摄片。具体方法：①肿瘤细胞密度：每张切片选择3个高倍镜非坏死区域视野综合判定,分为“密”(+)：肿瘤细胞聚集成巢，细胞间隙随处可见；“很密”(++)：肿瘤细胞紧密排列成巢，部分区域见到细胞间隙；“极密”(+++)：肿瘤细胞密集成堆,少见细胞间隙。②肿瘤细胞核分裂计数［6］：每张切片选择核分裂最多的区域,连续计数5个高倍镜不重复非坏死视野(hp),对核分裂像进行计数,取平均值,计算出每高倍视野的核分裂计数。③肿瘤间质淋巴细胞浸润程度分级：根据肿瘤间质中淋巴细胞浸润情况,分为稀疏散在分布(+)、中量程度浸润(++)及密布或聚集成团(+++)3个等级。
1.5.2 免疫组化法检测肿瘤细胞fasl表达采用链酶卵白素辣根过氧化物酶复合物法(lsab法),具体操作步骤按照说明书进行；实验设立阳性和阴性对照,阳性对照片为试剂公司提供的乳腺癌组织切片,阴性对照由磷酸盐缓冲液（pbs）代替一抗。评价标准：细胞膜或细胞浆有棕黄色颗粒沉着为阳性着色。在高倍镜视野(×400)下随机计数10个视野,记录阳性细胞占肝癌细胞总数百分比的平均值,即为fasl阳性表达指数。
1.6 统计学方法采用spss 115统计学软件。多组计量资料之间采用单因素方差分析,有序的分类资料采用ridit分析方法,均数之间的比较采用独立样本的t检验。
2 结果
2.1 各组肿瘤组织病理形态学观察情况
2.1.1 肿瘤细胞密度及细胞核分裂计数各组小鼠均未出现死亡现象,h22细胞腋下接种后第5～6天均能触及皮下大小不等的肿瘤。肿瘤组织病理形态学观察显示：模型组肿瘤细胞排列紧密,表现出细胞密度大,形态异形性明显；lbp高、低剂量组肿瘤细胞增殖密度均有不同程度的减小,细胞仍表现出一定的异形性,但经统计学处理各组间无显著性差异。
高倍镜下对各组进行肿瘤细胞核分裂计数,发现模型组明显多于lbp高、低剂量组,尤其是在每高倍视野下超过5个核分裂的标本较多,且多见病理性核分裂像,呈现不对称双极、三极、四极及多极性核分裂和顿挫型核分裂。而lbp高、低剂量组用药后可显著降低肿瘤细胞核分裂计数,与模型组比较差异均有显著性意义(p<005)。结果见表1。表1各组肿瘤细胞核分裂计数比较(略)
2.1.2 肿瘤间质淋巴细胞浸润情况淋巴细胞浸润常出现在肿瘤间质及肿瘤与正常组织交界处,模型组有10例标本淋巴细胞浸润较少,表现为稀疏散在的分布。而lbp高、低剂量组用药后,在肿瘤间质中及肿瘤与正常组织交界处,均可见较明显的淋巴细胞浸润现象,lbp高剂量组在肿瘤边缘组织内可见多量淋巴细胞浸润。lbp高剂量组肿瘤间质淋巴细胞浸润程度分级与模型组比较差异有显著性意义(p＜005)。结果见表2、图1（彩图见第201页）。表2各组肿瘤间质淋巴细胞浸润程度分级比较（略）
2.2 lbp对实验性肝癌小鼠肿瘤细胞fasl表达的影响图2（彩图见第201页）结果显示：模型组普遍存在fasl表达强阳性,肿瘤组织中fasl表达主要在细胞浆中,部分在细胞膜；lbp低剂量组部分肝癌细胞内fasl表达阳性,lbp高剂量组fasl仅在少量肿瘤细胞中表达。lbp低、高剂量组肿瘤细胞fasl表达指数显著下调,与模型组比较差异有显著性意义(p<005),结果见表3。表3各组对荷瘤小鼠肿瘤细胞fasl表达的影响（略）
同一组织切片中肿瘤细胞fasl表达情况与间质淋巴细胞浸润程度进行对比观察,发现fasl表达阳性高的标本,肿瘤间质中浸润的淋巴细胞数量相对较少,存在一定的负相关关系。
3 讨论
fas受体(死亡分子)和它的配体fasl(死亡因子),属于肿瘤坏死因子(tnf)受体和配体家族的跨膜糖蛋白,其之间的相互作用是细胞凋亡的重要途径之一。fasl分布于活化的t细胞、自然杀伤细胞(nk)、单核巨噬细胞以及免疫豁免区组织细胞表面［7］。t细胞在t细胞抗原受体(tcr)的诱导下,一方面被活化,另一方面被诱导表达fas和fasl。相邻的活化t淋巴细胞的fas和fasl相互作用可以彼此杀伤,活化t细胞表面fas/fasl相互作用也可导致直接自杀。另外,fasl还可以从细胞膜表面脱落下来,形成可溶性配体分子,这些可溶性分子可以通过自分泌或旁分泌的方式,作用于自身细胞和邻近活化t细胞,分别进行自分泌杀伤和旁分泌杀伤。
许多肿瘤细胞如黑色素瘤细胞、肺癌细胞、乳腺癌细胞均可表达大量的fasl［8］,有研究表明fasl表达阳性的直肠癌细胞更容易发生转移或转移后更容易生长,原因可能是fasl表达阳性的癌细胞可借此逃避免疫细胞的攻击［9］。本实验研究发现肿瘤模型组fasl阳性表达指数较高,与文献［1，8］报道一致,而lbp高、低剂量组用药后fasl表达水平下降,与模型组比较差异有显著性意义。由于肿瘤细胞增殖密度大小代表肿瘤细胞的增殖活跃程度,而核分裂像计数是评估肿瘤细胞增殖水平的有效方法之一,也代表肿瘤细胞的增殖活跃程度［10］,因此,本实验对照比较了各组肿瘤细胞增生密度、核分裂计数等指标,发现在lbp用药后,随着fasl表达下降,肿瘤细胞密度、核分裂计数有不同程度的减低。
肿瘤间质浸润淋巴细胞(til)的多少可以间接反映机体的免疫功能状况及对肿瘤细胞生长的抑制能力,肿瘤fasl(+)区较fasl(-)区具有明显的til凋亡,这可能是导致til数量减少,使肿瘤增殖局部产生免疫耐受的原因之一。有研究报道,肝癌fasl阳性患者til凋亡指数是fasl阴性患者的2倍［11］ 。本实验通过观察各组fasl表达情况与肿瘤间质淋巴细胞浸润情况,发现fasl表达与til数量之间有较密切的关系,在fasl表达较高的模型组,til数量较少,而lbp用药后,随着fasl表达的下降,til数量增加,表现出一定的负相关关系。本课题组通过流式细胞术检测了lbp对肿瘤微环境中til的影响,其相同的作用亦被初步证实［12］。
通过上述的实验结果,我们推测lbp可能通过下调肿瘤细胞fasl的表达,进而干预肿瘤细胞对免疫活性细胞的“反击”,使免疫活性细胞的凋亡减少,从而改善了肿瘤微环境中的免疫功能状态,促成肿瘤细胞生长的抑制。由于lbp提高了机体的抗肿瘤免疫功能,在整体上则表现出明显的抗肿瘤效应,其抗肿瘤确切机制有待进一步深入研究。
【参考文献】
［1］zhu q, liu j y, xu h w,et al. mechanism of counterattack of colorectal cancer cell by fas/fas ligand system［j］. world j gastroenterol, 2005,11：6125．
［2］abrams s i. position and negative consequences offas/fasligand interactions in the antitumor response［j］.front biosci,2005,10：809．
［3］陈庆伟,陈志桃.枸杞多糖药理研究进展［j］.海峡医药,2005,17(4):4.
［4］吴肖叶,徐亚利.枸杞在肿瘤治疗中的作用概述［j］.实用中医药杂志,1999,15(12)：43．
［5］刘彦平,李积东.枸杞多糖对小鼠nk细胞和白细胞活性的免疫调节作用［j］.青海医学院学报,2001,22(1):1.
［6］张天泽,徐光炜.肿瘤学［m］.天津：天津科学技术出版社,1996：375.
［7］马骐,孟令权,葛军,等.fas/fasl系统与肝癌细胞免疫逃逸的研究进展［j］.毒理学杂志,2007,21(6):508．
［8］郑立红,李玉兰,高莉莉.跨膜蛋白kai1和fasl蛋白在乳腺癌中的表达及临床意义［j］.中国老年学杂志,2009,29(6):709．
［9］shiraki k,tsuji n,shioda t,et al.expression of fas ligand in liver metastases of human colonic adenocarcinomas［j］. proc natl acad sci usa,1997,94(12):6421.
［10］谷彦军,古强,韩英杰,等.睾丸精原细胞瘤pcna标记指数和核分裂像计数相关性［j］.武警医学院学报,2002,11(2):68．
［11］张俊峰,石学涛,吴泰璜,等.fas表达在肝癌肿瘤免疫逃逸中的意义［j］.肿瘤防治杂志,2003,10(4):377．
［12］何彦丽,应逸,罗荣敬,等.枸杞多糖对荷瘤小鼠肿瘤微环境中ｔ淋巴细胞亚群及树突状细胞的影响［j］.中西医结合学报,2005,3(5)：374．influence of lycium
