作者：陈辉,卢卫国,陈纪藩,徐强,陈光星,刘清平
【摘要】 【目的】应用计算机辅助精子分析(casa)系统观察昆明山海棠对大鼠精子的毒性作用。【方法】选用18只成熟雄性sd大鼠随机分为2组,每组9只：正常对照组喂服生理盐水10 ml·kg-1·d-1,中药组喂服昆明山海棠水煎液75 g·kg-1·d-1。连续喂服60 d后,采用klinefelter扩散法收集大鼠附睾尾精子,采用casa系统观察精子计数、密度、形态、活动力。【结果】与正常对照组比较,中药组大鼠附睾的精子计数和密度显著下降(p＜001),检测视频下可见大量畸形精子,精子活动力下降为零。【结论】昆明山海棠水煎液对大鼠精子具有一定的直接毒性效应。
【关键词】 昆明山海棠/毒性 计算机辅助精子分析 精子/病理学 大鼠
abstract: objectiveto study the toxic action of tripterygium hypoglaucum hutch(thh) on rat sperms by computerassisted sperm analysis (casa) system. methodseighteen male sd rats with the weight of 180～220g were equally randomized into 2 groups: the normal control group were given normal saline in a dose of 10 ml·kg-1·d-1, and the experiment group were given thh water decoction in a dose of 75 g·kg-1·d-1. after treatment for 60 days, the rats were sacrificed and the sperms were isolated from the caudal epididymides of rats with klinefelter diffusion method. effect of thh on the motility, appearance, number and density of rat sperms was evaluated by casa system. resultsa significant decrease of the number and density of sperms was seen in the experiment group as compared with the control group(p＜001). in the experiment group the motility of sperm from caudal epididymides dropped to zero, and a large amount of teratosperms were found under microvideo camera. conclusionthh water decoction exerts certain direct toxic action on rat sperms．
key words:tripterygium hypoglaucum hutch/toxicity;computerassisted sperm analysis system;sperms/pathology;rats
昆明山海棠为卫矛科雷公藤属植物,药理作用与雷公藤相似,具有抗炎、调节免疫等作用［1］,治疗类风湿关节炎、强直性脊柱炎等自身免疫性疾病疗效肯定［2-3］,但生殖毒副作用限制了其临床应用。WWw.11665.cOM
计算机辅助精子分析(computerassisted sperm analysis, casa ) 为计算机支持的精液常规测试系统,该系统是视频技术与计算机技术的高度结合。既往在昆明山海棠的雄性生殖毒性研究中,尚未见借助casa 系统辅助精液分析的报道。本研究应用casa系统观察了昆明山海棠对大鼠精子的影响,现报道如下。
1 材料与方法
1.1 主要仪器和药品试剂for win95/98型精子自动分析系统,由北京中科恒业科技有限公司提货；zd44型标准恒温水浴箱,由杭州蓝天化验仪器厂提供；hanks缓冲液购自吉诺生物医药技术有限公司；昆明山海棠(产地广西)购自广州致信中药饮片有限公司,提取液由南方医科大学附属珠江医院中药制剂科煎制。
1.2 动物、分组与给药spf级纯种sd性成熟雄性大鼠18只,体质量180～220 g,由南方医科大学实验动物中心提供［实验动物合格证号:scxk(粤)20060015］。常规饲养4 d后,将大鼠随机分为2组,每组9只：正常对照组(简称正常组)喂服生理盐水10 ml·kg-1·d-1,昆明山海棠组(简称中药组)喂服昆明山海棠水煎液75 g·kg-1·d-1，连续喂服60 d后取材。
1.3 检测方法参考klinefelter［4］法,采用扩散法收集附睾精子。在直径35 mm培养皿中加入3 ml hanks缓冲液,放入恒温水浴箱中预温至37℃。大鼠称体质量,给予100 mg/l水合氯醛4 ml/kg麻醉。待大鼠翻身反射消失后,解剖大鼠,暴露腹主动脉,以止血钳夹住与右侧睾丸相连的血管组织,摘取右侧附睾,并立即置于3 ml预温至37℃的缓冲液中,用眼科剪在附睾尾近输精管端剪十字口,切口完全浸没于37℃的缓冲液中,随即有小量精液溢出,置37℃恒温水浴箱中,使精子自由扩散30 min。待精子充分扩散后,缓慢摇动培养皿, 使精子悬液混匀,调整精子的浓度为(60±10)×105/ml。用定量移液器吸取5 μl精子悬液至预温的玻片样品槽中(深度100 μm), 将计数板置于37℃显微镜载物台上,采用×10 反相物镜选取8个视野,用显微摄像机和dv录像机观察和记录精子的计数、密度、形态特征和运动状态。casa 仪主要参数设置:精子直径范围10～23 μm, 搜索半径(search radius)3238 μm,灰度阈值(thresholds) 40～100，采集分析的时间1～3min，非活动精子判定方式(immotile process)为手动。
1.4 统计学方法采用spss 115软件进行数据的统计处理。
2 结果
2.1 附睾精子形态、活力的观察正常组精子头部小而略带钩状,精子体部弯曲,如图1-a（彩图见第204页）。检测视频下大部分精子运动活跃。给药60 d后,采用casa仪观察附睾精子形态和活力,可见检测视野下中药组精子活动力全部下降为零,畸形精子数目明显增多,出现体部变直畸形,精子头部呈大圆头、小圆头畸形改变,如图1-b（彩图见第204页）。
表1结果显示,与正常组比较,中药组精子计数和密度显著下降(p＜001)．表1各组精子计数和精子密度比较 (略)
3 讨论
精子的发生和成熟,是一个连续的周期性过程,对大鼠而言,从精原细胞发展到成熟的精子需要约56 d［5］。本研究中连续给药60 d,可使昆明山海棠作用于整个雄性生殖细胞的生长、发育及成熟期,便于评估昆明山海棠对大鼠各个阶段生精细胞的毒性效应。
关于昆明山海棠雄性抗生育作用机制的研究,目前文献报道虽有不同,但大部分研究者［6-9］认为昆明山海棠能抑制精子的正常生成与成熟,导致少精、弱精和畸精,甚或无精，本研究结果与此一致。正常情况下,人与其他哺乳动物的精液中可有少量的畸形精子,但在某些生殖毒物的作用下,人和其他哺乳动物睾丸产生的畸形精子数大大增加。本研究结果表明,连续喂服昆明山海棠水煎液60 d后,与正常对照组比较,中药组大鼠附睾的精子计数和密度显著下降(p＜001),检测视频下可见大量形态异常的精子。这些畸形精子体部变直,失去正常成熟精子体部特有的弯曲形态,精子头部呈小圆头或大圆头畸形,精子活动力全部下降为零,表明75 g·kg-1·d-1剂量的昆明山海棠水煎液对精子的发生和成熟过程产生了明显的抑制作用。
精液分析是评估睾丸和附睾功能的重要指标,其所包括的睾丸精子计数、密度、活力及形态评估,是雄性生殖毒性的观察终点。传统的精液常规测定方法是利用显微镜进行主观判断,存在费时、信息量少、准确度差等缺陷。本研究引入casa系统,以不同的放大倍数透视全景,从监视视频上能清楚地观察精子,可客观定量地评价昆明山海棠对精子形态、精子计数、密度和运动状态的影响,直观反映昆明山海棠对大鼠睾丸精子的毒性作用,而且精子的运动图像还可以被保存在录像带上,便于日后进行更深入的研究分析。本研究结果为昆明山海棠的雄性生殖毒理学研究及casa在雄性生殖毒理学研究中的应用提供了一定的参考依据。
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