【摘要】 目的观察百草枯（pq）急性中毒大鼠所致肺损伤(ali)时核因子-кb和诱导型一氧化氮合酶(inos)的变化，探讨生脉对急性百草枯中毒所致肺损伤的保护作用。方法将50只sd大鼠随机分成5组，空白组、阴性对照组、阳性对照组、生脉低剂量组和生脉高剂量组。观察大体标本组织病理，同时测定肺组织核因子-кb和inos活性。结果与阴性对照组相比，生脉低剂量组肺组织病理显示肺淤血、肺水肿明显减轻；核因子-кb和inos也降低(p＜0.05或p＜0.01）。结论核因子-кb及inos在百草枯所致大鼠肺损伤中起重要作用，生脉注射液能降低核因子-кb及inos水平，减轻百草枯中毒大鼠肺组织损伤。
【关键词】 生脉注射液 百草枯 肺损伤 核因子-κb 一氧化氮 一氧化氮合酶
abstract:objectiveto invesigate the protective effect of pulse-activating injection against rat acute lung injury.methods 50 sprague- dawley (sd) rats were randomly divided into five experimental groups: blank group, negative control group, positive control group, pulse-activating injection low dose group(ldg), pulse-activating injection high dose group(hdg). macroscopic and histopathological examinations were performed, and the activities of lung tissue homogenate nk-кb and inos were measured. resultscompared with negative control group, and biological indexes of lung injury and the contents of nk-кb and inos were significantly decreased in pulse-activating injection groups (p＜0.05, p＜0.01).conclusionnk-кb and inos play important roles in lung injury of poisoned rats. pulse-activating injection can ameliorate the lung injury and decrease the levels of nk-кb and inos.
key words:pulse-activating injection; paraquat; lung injury; nf-κb; nitric oxide(no); inducible nitric oxide synthase (inos)
百草枯（paraquat, pq）以其良好的除草效果而在世界范围被广泛使用，但随之带来的误服或自杀性口服的极高死亡率又给医疗工作者提出了巨大的挑战。WWW.11665.coM百草枯中毒致死量小，肺组织中药物浓度最高，因此肺损伤最为严重，患者多死于呼吸窘迫综合征。人们尝试用各种方法 治疗 百草枯中毒，但迄今尚无特效解毒剂。研究表明，百草枯导致肺损伤的原因之一是核因子-кb和 inos活性的增高［1］，而生脉能明显降低急性肺损伤大鼠一氧化氮水平和诱导性一氧化氮合酶（inos）活性，因此生脉注射液用于慢性阻塞性肺疾病（copd）、慢性支气管炎、肺结核和中毒性休克等的治疗［2,3］，但用于百草枯中毒的治疗尚未见报道。因此本实验通过复制百草枯急性中毒大鼠模型，探讨生脉注射液对百草枯中毒所致急性肺损伤的保护作用及机制，为临床抢救百草枯中毒提供新的解救药物。
1 材料与方法
1.1 材料20%pq浓缩液（英国捷利康有限公司农药部）；生脉注射液（吉林省集安益盛药业股份有限公司，批号：080115）；地塞米松磷酸钠注射液（郑州卓峰制药厂）。鼠抗人单克隆nf-κb p65抗体（sc-8008）、sp免疫组化染色试剂盒（sp-9002）及浓缩型dab试剂盒（zli-9032）均购自北京中山生物技术有限公司；一氧化氮试剂盒，一氧化氮合酶测定试剂盒，考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒（均由南京建成生物工程研究所提供）。sha-ba型双功能水浴恒温振荡器（金坛市杰瑞尔电器有限公司）；xw-80a型涡旋混匀器（上海沪西分析仪器厂）；universal-16r型台式低温离心机（德国hettich entrifvgentd）； stat fax-2100型酶标仪（awareness techn- ologying）；ckx41倒置生物显微镜（日本oly -mpus）。
1.2 动物及分组sd大鼠称重后，空白对照组腹腔注射生理盐水30 mg/kg，其他组腹腔注射20%百草枯溶液30 mg/kg复制百草枯急性中毒模型。动物分组如下：①空白对照组(ns)：腹腔注射生理盐水4 mg/kg；②阴性对照组(pq)：腹腔注射生理盐水4 mg/kg；③阳性对照组(d)：腹腔注射地塞米松0.5 mg/kg；④生脉低剂量组(ldg)：腹腔注射生脉注射液0.2 ml/kg；⑤生脉高剂量组(hdg)：腹腔注射生脉注射液0.4 ml/kg。以上5组动物均给药2次/d，连续给药3 d。
1.3 标本的收集与处理用水合氯醛麻醉大鼠后开胸暴露出气管和双肺，腹主动脉取血处死，留取血清；并立即取出肺组织备用。
1.4 no测定精密称取一定量的肺组织，在持续95% (体积分数)o2-5% (体积分数)co2，37℃恒温条件下振荡孵育2 h，取孵育液100 μl，按试剂盒说明严格操作。
1.5 肺组织inos活性的测定速取肺组织适量，按1∶5(w/v)加入预冷的提取液，冰浴中匀浆，4℃，3 000 r/min离心10 min，收集上清液，用考马斯亮蓝试剂盒进行蛋白定量，inos试剂盒测定提取液inos活性。
1.6 肺组织nf-κb p65的测定采用免疫组化链霉亲和素-生物素标记（lsab）法进行染色，观察nf-κb p65在大鼠肺组织中的表达和分布情况。一抗选用兔抗鼠nf-κb p65多克隆抗体，稀释度为1∶100，用sp试剂盒，按说明书依次进行操作。镜下随机选取5个高倍视野， 计算 5个高倍视野中阳性细胞（以胞膜/胞浆/胞核出现棕黄色着色颗粒为阳性标记）占细胞总数的百分比。
1.7 组织学检查取少许肺组织，经10%甲醛固定，石蜡包埋切片，he染色后用显微镜观察肺组织损伤情况。
1.8 统计学处理实验资料以±s表示。两组以上资料采用one-way anova分析、组间newman-student-keuls检验进行统计学处理；两组资料采用student's t test处理。p<0.05认为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 肺组织no和inos的变化研究结果表明,pq组肺组织no浓度和inos活性明显高于ns组(p＜0.01），说明百草枯可引起肺组织产生大量no，并使肺组织inos活性增高。应用生脉、地塞米松进行干预治疗后，其肺组织no浓度和inos活性较pq组明显降低(p＜0.01，p＜0.05），因此生脉可抑制肺组织产生no并抑制inos活性，而且低剂量生脉效果更佳。结果见表1及图1～2。表1 肺组织中no，inos含量的变化（略）
2.2 肺组织中nf-κb p65表达的变化研究结果表明，ns组大鼠肺组织中nf-κb p65不表达或有很弱的表达，而pq组大鼠nf-κb p65有过强表达，二者比较有显著性差异（p＜0.01），说明百草枯中毒可导致肺组织中nf-κb p65的过表达；与pq组相比，d组和hdg组大鼠nf-κb p65表达稍有降低，但是无统计学意义（p＞0.05）；而ldg组大鼠nf-κb p65表达明显降低，二者比较有显著性差异（p＜0.01）。结果见表2及图3。表2 肺组织中核因子-κb p65表达的变化（略）与pq组比较，**p＜0.01；n=10
2.3 组织病 理学 改变正常大鼠肺呈粉红色，色泽光亮，质地柔软，中毒大鼠肺组织体积肿胀增大，呈暗红色，质地中等，可见边界清晰的大片淤血，生脉低剂量组肺色泽明显变浅，水肿减轻，肺呈小片状淤血。生脉高剂量组稍有改善。肺组织病理学检查可见：空白对照组大鼠肺泡结构清晰，肺泡壁薄，肺泡隔无增宽及充血，无炎性细胞浸润及出血现象。阴性对照组肺间质弥漫性出血，肺泡腔内可见大量红细胞渗出和巨噬细胞浸润，并伴有肺泡上皮细胞增生；阳性对照组肺充血稍减轻；而生脉低剂量组肺充血明显减轻；生脉高剂量组肺损伤稍有改善。此病理检测结果与“2.1”“2.2”项下生物指标检测结果一致。
3 讨论
核因子-кb（nf-кb）的激活与肺损伤和肺间质纤维化有密切关系［4,5］。一方面，nf-кb活化后可使宿主细胞细胞因子的基因转录增加，并激活其它细胞合成il-6、il-8等因子，形成一个nf-кb与细胞因子 网络 之间的正反馈圈，放大炎症反应，使肺损伤进一步加重;另一方面，nf-кb基因调控范围十分广范，除上述的前炎症因子外，还参与了一氧化氮合成酶（inos）的基因转录，对诱导型一氧化氮合酶（inos）的基因转录均有调控作用，使肺内no含量增加，后者作为自由基成分加重肺损伤［6］。而这些因素也均参与pq中毒肺损伤的发生。因此，抑制自由基产生及nf-кb活化的措施可能是 治疗 百草枯中毒的一个较好途径。
no是生物体内一种重要的信号分子，少量内源性no能促进血管舒张，改善组织微循环，介导细胞免疫对肺有保护作用。但no也是一种致炎因子，过量的no能促进巨噬细胞等炎性细胞分泌炎性介质，从而诱导多形核白细胞聚集，进一步导致呼吸爆发，生成氧自由基。且no含有未配对 电子 和超氧阴离子(o2-·)有很高的亲和力，两者结合产生过氧化硝基(onooˉ·)，onooˉ·质子化形成honoo，其本身为强氧化剂，可损伤细胞，破坏生物膜，引起或加重组织损伤［7］。另外，no作为第二信使主要由一氧化氮合酶(nos)生成，nos有3种，原生型(nnos)、内皮型(ennos)、诱导型(inos)。前二者主要在气道上皮细胞、肺血管内皮细胞；第3种由内毒素及多种炎症细胞因子刺激合成，常存在于肺泡巨噬细胞、中性粒细胞、血管平滑肌细胞、纤维母细胞及气道上皮细胞。inos激活后产生的过量no使炎性细胞在肺血管内皮细胞上粘附并相互作用，引起血管渗漏和肺水肿［8］。因此no含量增加和inos活性的提高是引起急性肺损伤的重要机制之一。
呼吸衰竭患者肺肾气阴极亏,心脉瘀滞表现为呼吸困难、发绀、自汗、纳差、烦躁或嗜睡,舌质干红无苔,脉微等危症［9］。生脉方有人参、麦冬、五味子3味中药组成。《方论》吴仪洛《成方切用》卷7：“肺主气，肺气旺则四肢皆旺；虚，故脉绝气短也。人参甘温，大补肺气而泻热，为君；麦冬甘寒，补水源而清燥金，为臣；五味酸温，敛肺生津，收耗散之气，为佐。盖心主脉，而百脉皆朝于肺，补肺清心，则气充而脉复，故日生脉。” 生脉具有益气养阴、生津止渴、敛阴止汗之功,使气复津回，汗止而阴存。
本实验结果表明，百草枯中毒大鼠给予低剂量生脉注射液治疗后使肺组织核因子-кb和诱导型一氧化氮合酶表达降低，因此可能对百草枯中毒有一定治疗作用。如果配合其他方法对百草枯中毒患者进行全方位治疗，争取延长患者生命，为进一步降低死亡率创造必要的条件。
【 参考 文献 】
［1］佟 飞, 田英平, 石汉文，等.急性百草枯中毒大鼠肺组织核因子-κb及诱导型一氧化氮合酶表达变化的研究［j］.
