nmdar亚单位1在ad样大鼠海马的表达及其与细胞凋亡的关系
【关键词】 nmda受体亚单位1;细胞凋亡;阿尔茨海默病;大鼠;海马
【摘要】 目的 探讨n甲基d天门冬氨酸受体(nmethyldaspartate receptor，nmdar，nr)亚单位1在阿尔茨海默病(ad)样大鼠海马的表达及其与细胞凋亡的关系。方法 以aβ140和alcl3双干预的方法建立ad样大鼠模型。应用免疫组织化学法检测nr1在ad样大鼠海马的表达，tunel法检测ad样大鼠海马细胞凋亡情况，并观察二者的关系。结果 nr1在ad样大鼠海马各区的表达均升高，与对照组相比有显著性差异(p<0.05)，区间比较未见显著性差异。凋亡阳性细胞在ad样大鼠海马各区均显著增多尤以ca1区为甚、其次为齿状回，与对照组比，差异有统计学意义(p<0.05)。结论 nr1在ad样大鼠海马表现为病理性的高表达且这种病理性高表达和ad样大鼠海马的细胞凋亡以及选择性易损伤现象之间可能存在着某种特定的关系。
【关键词】 nmda受体亚单位1;细胞凋亡;阿尔茨海默病;大鼠;海马
阿尔茨海默病(ad)发病机制的β淀粉样蛋白(aβ)级联反应假说认为，aβ的生成和蓄积是ad发病的中心环节〔1～3〕。氧化损伤，谷氨酸(glu)兴奋毒性，老年斑(sp)和神经原纤维缠结(nft)的形成以及细胞死亡级联反应的激活等，都被视为是继发于aβ生成和聚积的后续事件〔4，5〕。Www.11665.COmad可能与活动亢进的神经元有关，并且这些活动亢进的神经元最密集地集中在病变脑组织中淀粉样斑块沉积处的附近并且与疾病的症状相关联〔6〕。glu兴奋毒性通路在这个假说的数条主要信号通路中可能处于极其重要的地位，可能是引发ad患者神经细胞变性和死亡的一种重要机制。病理性胞浆ca2+超载主要是由n甲基d天门冬氨酸受体(nmethyldaspartate receptor，nmdar，nr)所介导，而nr1是ca2+通道的主要调节者，是nmdar介导glu兴奋毒性的主要组分〔7〕。目前对ad样细胞凋亡的确切机制仍不明确，至于nr1与ad样细胞凋亡的关系尚未见文献报道。本课题应用免疫组化和tunel染色的方法，研究nr1在ad样大鼠海马的表达及其与细胞凋亡的关系。
1 材料与方法
1.1 主要试剂和仪器
aβ140，alcl3(美国 sigma);山羊多克隆抗nr1抗体(美国 santa cruz);总抗山羊igg抗体(英国 abcam);浓缩型二氨基联苯胺(dab)试剂盒(北京中杉);原位末端凋亡法(tunel)试剂盒(德国 roche);碱性磷酸酶显色试剂盒(bcip/nbt，上海碧云天)。sr5r型脑立体定位仪(日本成茂);石蜡切片机(德国 leica);显微摄影系统(日本奥林巴斯);图像分析软件(美国 media cybernetics)。
1.2 方法
1.2.1 实验动物及分组
健康雄性老年sd大鼠45只，体重570～620 g，徐州医学院实验动物中心提供(实验动物许可证号：苏syxk20020038)。实验大鼠经训练和筛选后，随机分为ad模型组、生理盐水(ns)组和正常对照组(nc)，每组15只。
1.2.2 大鼠训练和筛选
所有参与实验的大鼠用morris水迷宫系统进行训练和筛选。4次/d，连续5 d。将大鼠面向池壁分别从4个入水点放入水中，记录其在2 min内找到平台的时间(逃避潜伏期)。如果在2 min内大鼠未能找到平台，则由实验者将其牵引至平台上并让其停留20 s，再放回笼中，始终不能找到平台的大鼠将被剔除。
1.2.3 ad样大鼠模型制备
模型组大鼠用10%水合氯醛(0.5 ml/100 g)麻醉后，将其固定在鼠脑立体定位仪上，参照文献〔8〕选取侧脑室立体定位坐标(以前囟为参照，旁开1.4 mm，后0.8 mm，深3.6 mm)。将微量注射器缓缓插入到定位好的坐标，缓慢注射0.5 mg/ml的aβ14030 μl〔aβ140用0.01 mol/l磷酸盐缓冲液(pbs)配制成0.5 mg/ml的溶液〕，在5 min内注射完，留针10 min;然后缝合皮肤并用碘伏消毒。ns组在侧脑室内注射等量生理盐水。单笼饲养直至大鼠完全清醒，昼夜(12/12 h)节律光照，自由进食饮水，室温控制在20℃～25℃。从第5天开始，以100 mg/kg的剂量隔日腹腔注射3% alcl3(ns配置)，持续4 w。
1.2.4 灌注固定及切片制备
行为学测试后，以10%水合氯醛(0.5 ml/100 g体重)腹腔麻醉大鼠，经心升主动脉插管灌注固定。取包含海马的脑块常规后固定、梯度酒精脱水、二甲苯透明，然后浸蜡、石蜡包埋。取包埋之脑块作连续冠状切片，片厚6 μm;切片分6套，分别进行nr1免疫组化、tunel、刚果红及苏木素伊红(he)染色和阴性对照染色。
1.2.5 免疫组织化学染色
切片常规脱蜡、复水后，入二乙胺乙四酸(edta)抗原修复液行微波修复，加3%h2o2(室温、10 min)，水洗，10%兔血清(室温1 h)，加一抗(1∶100，以含0.3% triton x100的0.01 mol/l pbs稀释，4℃ 48 h)，水洗，加生物素化兔抗山羊igg(1∶200，37℃ 30 min)，水洗，滴加辣根过氧化物酶标记链霉卵白素液(1∶200，37℃ 30 min)，水洗，以dab显色。阴性对照以一抗稀释液替代一抗，其余步骤相同。
1.2.6 tunel反应
切片常规脱蜡、复水后，入0.01 mol/l柠檬酸盐缓冲液(ph 6.0)的抗原修复液行微波修复，水洗，配置tunel反应混合液(tdt∶荧光素标记的dutp=1∶9混合，即5 μl tdt + 荧光素标记的dutp 45 μl)，加tunel反应混合液10 μl(盖上专用盖玻片，暗湿盒中反应，37℃ 1 h)，水洗，加10 μl converterap(盖上专用盖玻片，暗湿盒中反应，37℃ 30 min)，水洗，以bcip/nbt显色。常规脱水、透明、封片后镜检、拍照。阴性对照以荧光素标记的dutp替代tunel反应混合液，其余步骤相同。
1.3 图像分析与统计学分析
使用image j图像分析软件分别测量各区的nr1阳性细胞和凋亡阳性细胞的灰度值，以各测量点灰度值减去相应背景灰度值后的平均值作为海马各区的最终灰度值。采用spss16.0统计软件，数据以x±s表示。多个样本均数的比较采用双因素方差分析，组间比较采用t检验，多组与对照组比较采用最小显著差法。
2 结 果
2.1 nr1在ad样大鼠海马的表达
nr1免疫组化反应阳性细胞以胞膜着色为主、呈棕黄色，胞质淡然，有时可见核仁。与nc组和ns组相比，nr1在ad样大鼠海马各区的表达均显著增高，差异具有统计学意义(p<0.05)。与ns组相比，nr1在ad样大鼠海马ca1区、ca3区和dg区的增高幅度依次为150.21%、139.75%和136.72%;区间比较，增高的幅度虽有差异，但无统计学意义。见图1，图2。
2.2 ad样大鼠海马细胞凋亡的检测
tunel染色显示，在ad样大鼠海马各区均可见明显的凋亡阳性细胞，以ca1区最为显著，其次是dg区，再次是ca3区。凋亡阳性细胞的胞核呈深蓝色、形态不规则，有的固缩、有的裂解。与nc组和ns组相比，差异具有统计学意义(p<0.05)。ns组和nc组虽可见零星的凋亡阳性细胞，但应属于生理现象，且二者比较差异无显著性。见图3，图4。阴性对照脑片未见nr1免疫组化反应阳性细胞和tunel染色阳性细胞。与ad组比较：1)p<0.05，下图同图1 大鼠海马各区nr1免疫反应阳性细胞灰度值比较( x±s,n=5)图2 大鼠海马各区nr1免疫反应阳性细胞图片(sabc，×100)图3 大鼠海马各区凋亡阳性细胞染色强度的比较(x±s,n=5)图4 大鼠海马各区凋亡阳性细胞染色图片(tunel，×100)
3 讨 论
海马被认为是学习记忆的结构基础，海马功能障碍主要表现为特征性的学习和记忆功能的丢失，这与ad患者的主要临床症状和特征相吻合〔9，10〕。因此，本文选择海马作为研究对象。在转基因ad动物模型和ad患者脑内均发现cjun氨基末端激酶(jnk)信号通路被激活的证据，并认为这一途径与aβ沉积有关〔11〕。细胞凋亡是ad样细胞死亡的主要形式且此类细胞凋亡主要通过线粒体途径实现〔12〕。但目前对ad样细胞凋亡的确切机制仍不明确，胞浆内ca2+含量的增加被认为是细胞凋亡的启动因素，是激活内源性核酸内切酶而降解dna的先决条件〔13，14〕，而病理性胞浆ca2+超载主要是由nmda受体所介导，nr1又是ca2+通道的主要调节者，故推测在ad样大鼠海马nr1的表达和ad样细胞凋亡之间可能存在着某种内在的联系。
研究发现，nr1在ad样大鼠海马呈病理性高表达;同时tunel染色显示，在ad样大鼠海马可见明显的凋亡阳性细胞，二者具有一致性。nr1高表达介导细胞凋亡的可能机制是，aβ和alcl3干预以后，诱导nr1表达增高，导致ca2+通道过度开放、胞浆ca2+超载〔15〕。超载的ca2+一方面可能与钙调蛋白(cam)结合、导致钙调蛋白激酶ⅱ(camkⅱ)过度磷酸化，磷酸化的camkⅱ又作用于nr1促进其通道的开放，从而构成正反馈环路并形成恶性循环;另一方面，超载的ca2+将介导兴奋毒性损伤并产生大量的自由基，导致氧化应激和氧化损伤，最终通过线粒体途径导致细胞凋亡〔16〕。nmda受体尤其是和ca2+通道开放密切相关的nr1被认为是突触可塑性以及海马和皮质神经元长时程增强(longterm potentiation，ltp)的主要调控者，而ltp的损害与中枢神经退行性疾病密切相关〔17〕。因此认为，nr1的高表达除了导致细胞凋亡之外，还有可能通过影响海马神经元的ltp以及长时程抑制(longterm depression，ltd)的功能而导致ad样大鼠的学习和记忆功能障碍。
研究还发现，nr1在ad样大鼠海马表达的增高幅度依次为ca1区>ca3区>dg;tunel染色显示在ad样大鼠海马凋亡阳性细胞以ca1区为著、其次是dg、再次是ca3区。其中，nr1的高表达区间差异无统计学意义，这可能与ad的脑组织弥漫性病理学改变和损伤有关。ca1区和dg的凋亡阳性细胞比较有差异但无统计学意义，二者和ca3区相比皆具有显著性差异。该结果与文献报道的在ad转基因小鼠出现明显空间记忆障碍的同时，海马ca1区和齿状回的ltp受到显著损伤相一致〔18〕。ca1区和dg的ltp抑制显然与其细胞凋亡有关。海马对ad具有较高的敏感性和高度选择性，具有ad病变的基本特征，其中ca1区是海马结构中与人类学习记忆关系最为密切的功能区，也是ad的选择性易损区〔19〕，得到本研究的证实，而且本研究还为这种选择性易损伤现象提供了一个合理的解释，即这种选择性易损伤可能与nr1的高表达相关。同时本研究还提示，dg很可能是ad样大鼠海马的另一个选择性易损区，而ca3区则具有相对耐受性〔20〕。该结论尚未见相关文献报道，具体原因和机制有待进一步深入研究。
本实验结果提示，在ad样大鼠海马nr1的高表达很可能是诱导大鼠海马ad样细胞凋亡的主要原因。同时，nr1的高表达和细胞凋亡很可能是ad样大鼠海马ca1区和dg选择性易损伤而ca3区相对耐受的一个重要原因。若在ad早期给予针对nr1的特异性阻断剂也许能有效地防止ad样细胞凋亡的发生，从而减缓ad的发展进程并改善患者的学习记忆功能。至于nr1高表达诱导ad样细胞凋亡的具体路径以及ad样大鼠海马选择性易损伤的确切机制，有待从分子生物学角度和基因组学层面做进一步深入研究。
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