【摘要】 以化学氧化法制备了膨胀石墨，再以石蜡作为粘合剂制备了膨胀石墨电极，该电极兼备电化学传感器和富集待测物分子，缩短传质过程时间的特点。优化了测定条件，在此基础上建立了一种直接测定色氨酸的电分析方法。结果表明：在0.02～0.12 mmol/l范围内，电极响应与色氨酸浓度呈良好的线性关系，检出限为2.0×10－7 mol/l，rsd为2.4%。该电极具有良好的选择性，除酪氨酸外，浓度高达5.0 mmol/l (色氨酸浓度的100倍)的其它8种氨基酸在电极上均没有可测的响应。用该电极测定了医用氨基酸注射液中色氨酸的含量，结果与标称值相符。对色氨酸在膨胀石墨电极表面的富集原因和反应机理进行了初步探讨。
【关键词】 膨胀石墨电极 色氨酸 差分脉冲伏安法 选择性
1 引言
氨基酸的分析测试一直是人们研究较多的课题。检测氨基酸的传统方法主要有光谱法（包括紫外可见光谱、荧光、化学发光等），然而大多数氨基酸在紫外可见光谱区的吸收极弱，自身又无荧光，不能直接进行检测，通常需要衍生化处理提高检测的灵敏度和选择性[1]。
近年来，电化学法检测电活性氨基酸以其简单、灵敏、无污染等特点越来越受到人们的关注[2～6]。WWw.11665.Com膨胀石墨既有优良导电性和吸附性，又有良好的化学稳定性[7]，其用于电化学法检测电活性氨基酸却还未见报道。
本实验根据文献[8]制备了无硫膨胀石墨，以固体石蜡作为粘合剂制成膨胀石墨电极，该电极可用于色氨酸（trp）的直接电化学检测。应用差分脉冲溶出伏安（dpa）技术，成功地实现了trp的选择性检测，并具有较低的检出限和良好的重现性。用该电极测定氨基酸注射液中trp含量，结果与标称值相符。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
lk98bⅱ型微机电化学分析系统（天津兰立科化学电子高技术有限公司），460型fourier变换红外光谱仪（美国nicolet公司），d/max 2500型x射线粉末衍射仪（日本理学），mini 1240型紫外可见分光光度计（日本岛津公司），phb1型酸度计（上海世诺物理光学仪器有限公司），asap 2010c型吸附仪（美国 micromeritics公司），电化学检测系统采用三电极体系：工作电极为自制的膨胀石墨电极，参比电极为饱和甘汞电极（sce），对电极为铂丝。
色氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、谷氨酸、缬氨酸、丙氨酸、组氨酸（中国医药集团上海化学试剂公司）；酪氨酸、胱氨酸和半胱氨酸（上海润捷化学试剂有限公司）；复方氨基酸注射液(18aa)(批准文号：国药准字h 19993589， 四川科伦药业股份有限公司）。其它化学试剂均为分析纯。所用水为18.3 mω cm超纯水。
2.2 膨胀石墨电极的制备
根据文献[8]，以化学氧化法制备膨胀石墨。准确称取膨胀石墨与固体石蜡（质量比为2∶3）于烧杯中，微热至石蜡全熔（熔点为56～62℃），同时搅拌使两者混合均匀。冷却至室温后，将混合物填入长720 mm×5 mm i.d.的玻璃管一端，填充深度为 0.5 mm，插入φ=2 mm的铜丝实现电路连接。将电极截面抛光，用去离子水冲净后待用。重新抛光可使电极表面更新。
2.3 实验方法
将以膨胀石墨电极为工作电极的三电极体系置于含50 μmol/l trp的kcl溶液中，用hcl调其ph值至2.0。用dpa法记录ie曲线，实验条件为：－0.1 v电位下富集80 s，从0.4 v扫描到1.3 v。其它氨基酸的测定方法相同。测定前，所用溶液均通氮气除氧。
３ 结果与讨论
3.1 膨胀石墨电极的电化学窗口
分别以膨胀石墨电极和碳糊电极为工作电极，在－1.2～1.6 v（vs. sce）的电化学窗范围内，在支持电解质溶液（kcl，ph 2.0）中进行cv扫描。由图1可知，膨胀石墨为工作电极时，由支持电解质引起的背景电流与用碳糊为工作电极相比，几乎可以忽略不计，这说明膨胀石墨非常适合在实验所选用的条件下作工作电极。同时，这两种电极的电位窗上限（1.6 v）都高于水的分解电位（1.2 v），这也说明用膨胀石墨电极进行电化学检测时，水不会发生分解而干扰氨基酸的检测。
3.2 色氨酸在膨胀石墨电极上的电化学响应
3.2.1 石蜡含量对峰电流的影响 考察trp在不同含量石蜡的电极上的电化学响应，石蜡含量为40%时，基线噪音小、峰电流最大。所以，实验选用含40%石蜡的膨胀石墨电极为工作电极。
3.2.2 电解液的类型及ph值对峰电流的影响 考察了trp在不同电解液（邻苯二甲酸氢钾、hcl、h2so4、kcl、kno3）中的电化学响应，当用kcl作支持电解质时，得到的trp氧化峰的峰形好，峰电流也较大。同时考察了不同浓度的kcl溶液，其浓度对峰电流影响不大，因此，本实验选用0.1 mol/l kcl作为电解液。
考察了trp在ph 1.0～10.0范围内的kcl溶液中的电化学响应。当trp浓度为5.0×105 mol/l时，按上述的实验条件用dpa法测定。ph值与其氧化峰电流的关系如图2所示，得到在ph 2.0的溶液中，峰形最好，且trp的氧化峰电流最大，故选ph 2.0的0.1 mol/l kcl作为电解液。
图1 膨胀石墨电极(a)和碳糊电极(b)的循环伏安图（略）
fig.1 cyclic voltammograms of expanded graphite(a) and carbon paste(b)
电解液(electrolyte): 0.1 mol/l kcl(ph =2.0); 扫描速度(scan rate): 100 mv/s。
图2 色氨酸氧化峰电流与ph的关系图（略）
fig.2 ｒelationship between oxidation peak current of tryptophan (trp) and ph value
电解液 (electrolyte)：0.1 mol/l kcl; 色氨酸 (concentration of trp): 5.0×105 mol/l; 富集电位(enrichment potential)：－0.1 v; 起止电位(initial and terminal potential)： 0.4～1.3 v; 富集时间(enrichment time)：80 s。
3.2.3 色氨酸的氧化峰电流与富集电位和富集时间的关系 将膨胀石墨电极置于上述相同溶液中，分别在－0.4、－0.3、－0.2、－0.1、0.0、0.1和0.２ v的电位下富集80 s。当富集电位为－0.1 v时，峰电流达到最大值，如图3所示。故实验选择富集电位为－0.1 v。
图3 色氨酸氧化峰电流与富集电位的关系图（略）
fig.3 ｒelationship between oxidation peak current of trp and enrichment potential
电解液(electrolyte)：0.1 mol/l kcl (ph=2.0); 色氨酸(trp): 5.0×105 mol/l; 起止电位(initial and terminal potential)：0.4～1.3 v; 富集时间(enrichment time)：80 s。
将膨胀石墨电极置于含50 μmol/l trp的kcl（ph=2.0）溶液中，在－0.1 v时分别富集20、40、60、80、100、120和200 s。结果表明。当富集时间＜80 s时，trp的氧化峰电流随着富集时间的增加而迅速增大，随后trp在电极表面的吸附趋于饱和，峰电流基本不变。所以本实验选择富集时间为80 s。
3.3 膨胀石墨电极的分析性能
实验结果表明，当trp的浓度在0.02～0.12 mmol/l时，其氧化峰电流与其浓度之间有良好的线性关系，线性回归方程为y=2.204 +168.66x，r为0.9928，检出限为2.0×10－7 mol/l（s/n=3）。
电极立即检测与放置2个月后再进行检测的结果相比较，trp的氧化峰电位和峰电流均无明显变化，说明该电极的稳定性良好。平行测定50 μmol/l trp溶液8次，rsd为2.4%，说明电极具有良好的重现性。
3.4 其它氨基酸对色氨酸测定的干扰
当trp浓度为5×10－5 mol/l 时，按相同的实验方法，对100倍浓度的苯丙氨酸、赖氨酸、谷氨酸、缬氨酸、丙氨酸、组氨酸、酪氨酸、胱氨酸、半胱氨酸进行测定，除酪氨酸（tyr）有电化学响应外，其余氨基酸均无响应。但在实验条件下，两倍浓度的tyr不影响trp的测定（图4）。可见该电极具有较好的选择性，对于一般样品可直接测定其中trp的含量。
图4 色氨酸(a)和酪氨酸(b)在膨胀石墨电极上的dpa图（略）
fig.4 differential pulse stripping voltammograms of trp(a) and tyr(b)
trp: 5.0×10－5 mol/l; tyr: 1×10－4 mol/l；电位增量(potential increment)：0.01 v；脉冲幅度(pulseamplitude)：0.1 v；脉冲宽度(pulse width): 1.0 s；脉冲间隔(pulse interval)：0.2 s；平衡时间(equilibrium time)：10 s；其它条件同图3 (other conditions are the same as in fig.3)。
3.5 实际样品的测定
膨胀石墨电极为工作电极，采用选定的实验方法对复方氨基酸注射液中的trp（稀释后trp的含量为3.14 mg/l）做加标回收实验，结果见表1。
表1 复方氨基酸注射液中色氨酸的加标回收实验结果（略）
table １ recovery of trp in compound amino acid injection samples
3.6 电极反应机理的探讨
实验所用电极是膨胀石墨和固体石蜡的混合物。文献[9]报道了液体石蜡对trp和tyr均有萃取富集作用，但未见有关用固体石蜡对氨基酸选择性富集的报道。图5a是仅用膨胀石墨萃取前和萃取5、15和90 min后trp的紫外光谱图。由图5知，trp在最大吸收波长217 nm处的吸光度随萃取时间而降低，萃取90 min后，吸光度降低了83.1%，表明膨胀石墨对trp有很强的萃取富集作用。
图5 trp(a)和tyr(b)被膨胀石墨萃取不同时间的紫外光谱图（略）
fig.5 uv spectra of trp (a) and tyr (b) extracted by expanded graphite at different time
trp：0.05 mmol/l；tyr：0.05 mmol/l; 膨胀石墨用量(the amount of expanded graphite)：0.1088 g; 萃取富集时间(extracting time) 1～4：0，5，15，90 min。
而仅用固体石蜡萃取150 min后，trp的紫外光谱图和萃取前完全重合，这说明固体石蜡对trp的富集作用与膨胀石墨相比很小。同时研究了膨胀石墨对tyr萃取前后的紫外光谱图，如图5b。萃取90 min后，tyr在最大吸收波长222 nm处的吸光度仅下降了28.2%, 说明膨胀石墨对tyr的萃取富集效果远弱于其对trp的。紫外光谱结果也是3.4节dpa实验现象的一个有力证据。
膨胀石墨电极作电化学传感器，更为显著的特点是能富集trp正离子，缩短传质过程时间。trp在电极表面的富集可能是3种效应的协同作用：第一种是静电吸引效应，由于富集电位－0.1 v，最佳ph值为2.0，在此ph下，trp呈正离子形式，电极和trp正离子之间存在静电吸引；第二种是吸附效应，比表面积的测定结果证实，膨胀石墨的比表面积为41.38 m2/g，远大于石墨粉的比表面积(3.36 m2/g), 大的比表面积使得膨胀石墨电极具有强的吸附效应；第三种是氢键效应，制备膨胀石墨过程中，使用了hno3和kmno4等强氧化剂，可能将含氧基团(如oh、ｃｏoh等)引到膨胀石墨上，这一假定也从天然鳞片石墨和膨胀石墨的红外光谱图得到了证实 (见图6)。天然鳞片石墨在3434 cm－１处有很弱的水吸收峰，这可能是来自样品和用于压片的kbr晶体中微量水分；而膨胀石墨在3444和1636 cm－１的吸收峰均显著增强。因为两者进行红外实验时的条件完全相同，因此oh吸收峰增强可归咎于制备膨胀石墨过程中引入的含氧基团——羟基，使trp通过氢键效应富集到电极表面。所以trp在电极表面的富集是静电吸引、吸附效应和氢键效应的协同作用结果。
图6 天然鳞片石墨(a)和膨胀石墨(b)的红外光谱图（略）
fig.6 ir spectra of natural graphite flakes(a) and expanded graphite(b)
制备膨胀石墨过程中引入含氧基团还可以通过xrd结果来说明（图略）。与天然鳞片石墨相比，膨胀石墨衍射峰位置不变（2θ=26.2°），但强度降低，这说明天然鳞片石墨经氧化插层后，由于含氧基团的插入，使其晶体结构在一定程度上被破坏，结晶度有所下降，导致膨胀石墨的衍射峰强度降低。
在dpa实验条件下，富集于电极表面的trp发生电化学氧化，反应过程如下:
图7 trp在膨胀石墨电极上的cv图（略）
fig.7 cyclic voltammograms of trp on expanded graphite electrode
1. 第一圈 (the first cycle); 2. 第二圈 (the second cycle); 3. 第三圈 (the third cycle)。 (1)
(2)
(3)
将电极置于含2.0×103 mol/l trp的kcl（ph=2.0）溶液中，在0.7～1.3v范围内进行连续cv实验。从图7可见，1.0 v附近出现氧化峰，但反向扫描时无还原峰，说明电极反应过程不可逆，是典型的受吸附控制的电极反应类型；且随扫描次数增多，氧化峰电流逐渐降低，这也证实了电极反应过程受吸附控制。从图7不难判断出，在静电吸引、吸附效应和氢键效应这3种导致trp在电极表面富集的因素中，吸附效应是最主要的。
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