摘要：以小麦（triticum aestivum linn.）为材料，以不同浓度梯度的叠氮钠溶液处理小麦叶片后，采用彗星实验研究叠氮钠对小麦的遗传损伤。结果表明，叠氮钠能引起小麦基因的损伤，并随浓度的增加伤害程度加大，表明叠氮钠有明显的遗传损伤毒性，彗星实验可以利用植物细胞快速检测环境中对遗传物质有毒性的物质，是一种快速、简单、直接检测 dna损伤的手段。
　　关键词：彗星实验；叠氮钠；小麦（triticum aestivum linn.）；遗传损伤
　　中图分类号：x173；s512.1 文献标识码：a 文章编号：0439-8114（2013）07-1502-03
　　目前，致突变物的检测是环境监测的重要内容之一。过去大量采用微核试验、染色体断裂和ames实验，但是这些方法都是在大量烦琐试验的基础上建立起来的，且花费高，不利于广泛采用[1]。彗星实验（comet assay）又称为单细胞凝胶电泳（single cellgel elelectrophoresis，scge），最早由ostling等[2]提出。彗星实验可以定量检测真核细胞中的多种dna损伤，如单、双链断裂，碱性不稳定位点，不完全切除修复位点和dna交联等[3]。在之前的研究中，彗星实验多是利用动物细胞dna的损伤检测环境污染物质的致突变性和基因毒性，直到1996年koppen等[4]第一次报道了利用植物为材料进行彗星实验检测环境污染物质对基因的损伤。此后不断有人利用植物彗星实验进行环境致突变物的检测[5]，表明植物彗星实验和动物细胞彗星实验一样可靠，提供了环境污染检测的一种手段，但是对叠氮钠遗传损伤研究以微核居多，尚未有文献应用叠氮钠进行彗星实验研究其毒性。www.11665.com本研究以小麦（triticum aestivum linn.）为材料，应用植物彗星实验技术初步研究了叠氮钠对小麦叶片细胞dna的损伤，以期为慧星实验进一步应用于植物基因毒性检测提供依据。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　1.1.1 材料 小麦品种由南阳师范学院生命科学与技术学院遗传学实验室提供。
　　1.1.2 药品 叠氮钠（nan3）、无水乙醇、氯化钠（nacl）、氢氧化钠（naoh）、乙二胺四乙酸二钠（na2-edta）、重铬酸钾（k2cr2o7）、溴化乙锭（eb）、三羟甲基氨基甲烷（tris）、二甲基亚砜（dmso）、正常熔点琼脂糖（nma）、低熔点琼脂糖（lma）、trtionx-100、纤维素酶、果胶酶、去离子水等。
　　1.1.3 主要仪器 nikon荧光显微镜（中英昆虫生物学联合实验室提供）、dyy-8c电泳仪、单面磨砂载玻片、盖玻片（24 mm×50 mm）、移液枪及枪头（各种规格）、离心管（各种规格）、恒温水浴锅、恒温培养箱、手动计数器、玻璃培养皿、烧杯、锥形瓶、玻璃棒、容量瓶、剪刀、纱布、滤纸、冰箱、吹风机等。
　　1.2 方法
　　1.2.1 小麦叶片的处理和细胞核分离 采用去离子水无污染基质培养的小麦叶片，将其下端浸入浓度0（ck，用0.1 mol/l、ph 6.8的磷酸缓冲液浸泡）、100、500、1 000、2 000 mg/ml的nan3溶液，于黑暗中25 ℃下处理4 h或过夜。处理结束后，取出叶片置于已在冰上预冷的无菌玻璃培养皿中。为避免光线对结果的影响，所有操作均在暗光或红光灯下进行。叶片冷冻10 min后采用机械分离的方法获得细胞核[6，7]，向培养皿加入一定体积的磷酸缓冲液，用无菌刀片在该缓冲液中轻轻将小麦叶片顺叶脉切开并轻轻转动培养皿，收集冲洗液于无菌的1.5 ml离心管中，加入2%纤维素酶和果胶酶溶液在55～65 ℃下反应约5 min，使叶片细胞核进入缓冲液获得细胞核悬液[8]。
　　1.2.2 电泳胶板制作 大多数实验常用“三明治”型3层凝胶结构，但有文献指出3层凝胶结构容易脱落[9]，经多次预实验，本实验采用2层凝胶结构。第一层为正常熔点的琼脂糖，第二层是低熔点琼脂糖和细胞核悬浮液的混合层。先制备第一层琼脂糖，将用95%乙醇浸泡过夜的单面磨砂载玻片干燥后水平放于滤纸上，用移液枪及预热至85 ℃的无菌枪头取预热至65～75 ℃的浓度为0.65%的正常熔点琼脂糖100 μl于载玻片上，迅速盖上洁净的盖玻片使其凝固，以获得黏附力强、均匀一致的琼脂糖层[10]。第一层琼脂糖准备好以后，将其放入4 ℃冰箱中预冷，待其凝固后取下盖玻片。取小麦叶片细胞核的悬浮液与预热至37 ℃的1%低熔点琼脂糖按1∶3（v/v，总体积为100 μl）混合均匀，滴在上述准备好的载玻片上，迅速盖上洁净的盖玻片，再放置到4 ℃下使其凝固。
　　1.2.3 细胞裂解 小心移去盖玻片，用吹风机小心垂直轻吹胶板平面，使残余

水分蒸发除去，以免裂解时胶面脱落。将载玻片置于无菌平皿中，轻轻加入预冷的新配制的细胞裂解混合液（ph>13）浸没玻片，在常温下裂解1 h或过夜[11]。小心取出载玻片，用去离子水轻轻漂洗2～3次，动作要求轻柔，以免胶面脱落。
　　1.2.4 dna解旋 将载玻片置于水平电泳槽阳极端，并列放置，不留空隙。倒入新配制碱性电泳缓冲液覆过载玻片0.25 cm，放置20 min，使dna变性解旋和产生，使dna断链在电场中易于迁移。
　　1.2.5 电泳 变性结束后在稳压35 v、200 ma下电泳30 min。
　　1.2.6 中和 电泳结束后取出玻片用去离子水冲洗3次，并用滤纸吸去多余的水分，放入无菌小玻璃培养皿，沿皿壁加入tris-hcl（ph 7.5）缓冲液，将载玻片淹没15 min，再将tris-hcl吸去，用滤纸将皿内液体吸干再缓缓加入无水乙醇，将载玻片浸埋1 h，吸去乙醇，晾干或室温下过夜。
　　1.2.7 染色与观察分析 每个载玻片加入30 mg/ml的溴化乙锭溶液50 μl染色20 min后，用nikon 荧光显微镜在绿激发光下观察，用随机软件在自动曝光条件下用冷ccd拍照并获取彗星图像[12]，每张载玻片观察25个细胞，一个处理做4张玻片，一个处理共计观察100个细胞，计下拖尾细胞数，求出细胞拖尾率，以x2检验其显著性，同时用casp软件分析各组平均尾长和标准差，以t检验检测其显著性，分析评价dna的损伤程度。 　2 结果与分析
　　2.1 不同浓度叠氮钠溶液处理的小麦叶片彗星图
　　不同浓度叠氮钠溶液对小麦叶片dna损伤结果如图1所示。图1a为对照，叶片细胞dna基本上未发生损伤，在荧光显微镜下观察，只有一个圆形的荧光头，没有拖尾；图1b至图1e为不同浓度叠氮钠溶液处理后的彗星图，发生了不同程度的拖尾，但因放大倍数过小图像不甚清晰。从图1可以看出，随着叠氮钠溶液的浓度逐渐增大，dna受损也愈重，产生的断链或断片就愈多，其断链或断片也就愈小，在电场作用下迁移的dna量愈多，迁移的距离愈长，表现为彗星尾长增加和彗星尾部荧光强度增强。
　　2.2 不同浓度叠氮钠溶液处理的小麦叶片细胞dna迁移效应
　　casp软件分析测定结果见表1。由表1可知，浓度为100～2 000 mg/ml的叠氮钠溶液处理的细胞出现较多拖尾，拖尾率高，各处理与对照相比差异达极显著水平。对照有7.3%细胞有拖尾现象，在理想条件下，对照细胞不发生拖尾现象，但细胞本身的状态，以及操作中的一些细微损伤都可造成部分细胞发生拖尾，只要对照组细胞和处理组细胞其他处理条件相同，这些误差可忽略不计，即对照细胞发生拖尾在彗星实验允许范围之内[13]。彗星尾长随叠氮钠溶液浓度的增大明显增长，说明叠氮钠溶液剂量越大对叶片细胞dna的损伤越严重，各处理与阴性对照差异均达极显著水平（表1）。进一步对叠氮钠浓度（x）与彗星尾长（y）的关系进行分析，数据经计算机曲线拟合，二者符合有截距的线性模型（图2）：y=0.168 5x+152.8，r2=0.780 8，说明叠氮钠对叶片细胞dna损伤存在明显的剂量效应关系。
　　3 讨论
　　以上结果表明，叠氮钠毒性与小麦细胞dna损伤存在线性关系，具有明显的遗传损伤毒性，彗星实验可以利用植物细胞快速检测环境中对遗传物质有毒性的物质，是一种快速、简单、直接检测dna损伤的手段。
　　林爱军等[5]利用彗星实验研究镉对小麦叶片的dna伤害，初步建立了植物彗星实验系统，得到了较好的结果。本研究利用叠氮钠建立植物彗星实验系统，由于实验条件的差异，彗星实验对各种条件的变化比较敏感，各种处理条件的变化直接影响实验最终结果，因此本实验参数有待进一步优化。
　　采用的材料小麦是世界上总产量第二的粮食作物，也是我国主要的粮食作物之一，其质量和产量对农业生产具有重大意义，小麦的良种选育也是当前农业生产的重要问题。在遗传良种引种工作中，对引种环境的风险评估是一项很重要的工作，环境条件直接限制良种遗传性状的表达，而彗星实验对环境细微dna损伤比较敏感，为我们进行环境检测评估提供了一种可靠而简便快速的方法。
　　植物细胞检测系统的结果外推于人类时，由于植物细胞与人类细胞在结构和生化代谢各方面差距甚远，诱变剂进入靶分子的方式及作用机理不甚相同，因此实验研究还有待于结合相应的病理学调查。但是彗星实验技术具有特殊优点有着广泛的应用前景，并且实验所用材料属于真核生物，更能直接推测诱变物质对人类或其他高等生物

的遗传危害，是一种比较理想的遗传毒理学检测方法。
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