摘要 对临床疑似猪链球菌9型(ss9)的病料进行实验室诊断。通过实验室检测结果证实,分离菌属于ss9,将其命名为qz49;扩增其cps9h目的基因长为389 bp;与genbank上国内外ss9毒株核苷酸同源性介于97.2 %~99.5 %之间。
　　关键词猪链球菌9型;cps9h基因;分离;序列分析
　　
　　近年来,猪链球菌9型的流行趋势逐渐上升,在我国各省(市)均有不同程度的发生和流行[1-2],ss9已逐渐成为危害我国养猪业发展的疫病之一。本研究就钦州疑似ss9症状的病料进行细菌分离、pcr扩增,并进行测序分析,以期为ss9的分子流行病学提供数据支持。
　　1材料与方法
　　1.1标准毒株及主要试剂
　　猪链球菌9型标准毒株(y142株)由广西动物疫病预防控制中心实验室提供。dntp、taq酶、蛋白酶k、sds、饱和酚等购自takara公司;lb培养基购自gibcol公司。
　　1.2引物
　　根ss9荷兰5218株设计扩增cps9h基因引物:cps9h1:5′-ggctacatataatggaagccc-3′;cps9h2:5′-ccgaag tatctgggctactg-3′,预期扩增片段长约389bp。
　　1.3细菌培养、纯培养及涂片镜检
　　采集某猪场疑似ss9型症状的病料接种鲜血琼脂培养基,37 ℃培养12 h后观察。挑选可疑的单个菌落接种于链球菌增菌培养基中,37 ℃培养20 h收取细菌液体培养物,涂片、革兰氏染色镜检。WwW.11665.com
　　1.4细菌的涂片镜检与dna的抽提
　　取细菌纯培养物,涂片、革兰氏染色镜检。之后取液体培养物1.5 ml按传统dna抽提方法抽提dna,获得的dna模板用于下一步操作。
　　1.5cps9h基因扩增
　　取抽提的dna模板进行cps9h基因的扩增,反应体系总体积25 μl,内含模板2.0 μl,加10×reaction buffer 2.5 μl,dntp(2.5 mmol/μl)2.0 μl,taq dna酶(5 u/μl)0.25 μl,mgcl2(25 mmol/l)1 μl,上下游引物(25 pmol/μl)各0.5 μl,加ddh2o补至25 μl,置pcr仪中,95 ℃ 预变性5 min;94 ℃变性45 s,56 ℃退火45 s,72 ℃延伸60 s,30个循环;72 ℃延伸10 min。完毕后取pcr产物5 μl在10 g/l琼脂糖凝胶上电泳,置凝胶成像系统中观察结果。
　　1.6cps9h基因序列分析
　　pcr阳性产物纯化后送宝生物工程(大连)有限公司测序。应用dnastar软件将测序获得的ss9毒株cps9h基因序列截短并进行整理,与国内外已发表的ss9 cps9h基因序列进行核苷酸同源性分析,建立系统发育树。
　　2结果与分析
　　2.1细菌培养特征
　　该细菌在鲜血培养基上菌落呈针尖大小,圆形隆起,湿润透明,灰白色,为β-溶血;在血清肉汤中管底混浊呈沉淀状。革兰氏染色为g+菌。初步证实该分离菌属于猪链球菌9型。
　　2.2pcr扩增结果
　　扩增产物经10 g/l琼脂糖凝胶电泳,得到单一的约390 bp大小的目的片段(图1)。
　　2.3测序结果及核苷酸同源性分析
　　通过测序,得到389 bp核苷酸序列(图2)。用dnastar软化进行同源性分析,qz49株与荷兰5218株的同源性是98.7%;与广西y142、南京ha070725、湖北hb21都为99.5%;与河南hn、湖北hb22分别为98.2%和99.2%;与广州gz0565同源性最低,仅为97.2%。
　　3结论与讨论
　　在猪链球菌35个血清型中,cps9h与其他34个血清型的序列同源性都很低,是国内外目前利用pcr技术鉴别诊断猪链球菌9型引物的主要基因组。ss9是继ss2型之后的主要流行血清型,主要流行于澳大利亚、德国、比利时和荷兰[3]。近些年来,在我国各省(市)也有关于ss9的报道[4-6],研究证实了ss9毒株确实已在钦州市的猪群中存在。序列分析结果显示,钦州分离株与国内外其他ss9毒株核苷酸同源性都较高。研究结果表明,钦州市现在流行的ss9毒株与国内外的流行毒株基本一致,没有发生太大的变异,预示在临床上重视控制ss2感染的同时,还应该加强防控ss9,以防在钦州市猪群中形成大规模的流行。
　　4参考文献
　　[1] 余炜烈,李春玲,王贵平,等.猪链球菌2型和9型广东分离株的病原特性[j].