原文作者：王鹤，曹文广

　　摘要：应用玻璃针将脂质体包裹的质粒pegfp-c1通过睾丸输出管注射到4周龄昆明（km）小白鼠睾丸曲精细管内。共注射6只小鼠，其中一只注射后马上做石蜡切片观察转染液注射入曲细精管内的情况，其他5只继续饲养，1周后取1只小鼠培养睾丸的支持细胞，观察是否有荧光出现。4周后，用pcr法检测剩余4只小鼠睾丸组织曲细精管基因组中的外源dna，4只都显示为阳性。表明用睾丸输出小管注射法将外源基因导入小鼠睾丸是一条简便可行的新途径。
 　　关键词：小鼠；转基因；睾丸输出管注射法
　　中图分类号：s865.1文献标识码：adoi编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.04.008
　　construction of transgenic mice by testicular efferent duct injection
　　wang he1，2， cao wen-guang2
　　（1. college of animal science， xinjiang agriculture university， urumqi， xinjiang 830052， china； 2.institute of animal science， chinese academy of agricultural sciences， beijing 100193， china）
 　　abstract： using glass needle plasmid pegfp-c1 liposome-encapsulated was injected into the testicular efferent of 4 weeks male km mice. do immediately after an injection of paraffin sections to obserne the transfection solution was injected into the seminiferous tules， remanent mouse to continue to raise， after a week， take one mouse cultivating testicular sertoli cells. after four weeks， exogenous dna in the pcr method for detecting the remaining four mouse testis seminiferous tubules genome， all as positive. the result indicated that the data in this study to transgenic animals could be established by testicular efferent injection.
 　　key words： mice；transgenic；testis efferent injection [论文网]
　　转基因动物在生命科学、医学、生物制药等领域有着广泛的研究和应用前景， 因此，科学家们一直在探索一种更简便易行、经济实用而又高效的转基因方法。WWW.11665.cOm有研究者应用曲细精管微注射法建立了转基因动物[1-4]，该方法只需注射、交配、检测3个步骤，简便易行。精原干细胞的移植首先由brinstre等[5]报道，他们先将可育小鼠的混合生精细胞移入不育小鼠的曲细精管，结果在受体睾丸内产生了具有受精能力的精子。目前，利用雄性动物生殖细胞建立转基因动物的方法成为许多科学家关注的对象。将携带外源基因的转染液注射到睾丸曲细精管中[6]，体内直接转染生殖细胞，产生转基因精子，通过动物自然交配最终获得转基因动物。这种体内转染的方法简单，易于操作，产生转基因动物周期短，制备环节少。就目前而言，最大的优点是成功避开了体外培养生殖干细胞的困难。本试验用显微注射针将脂质体包裹的质粒载体pegfp-c1，通过睾丸的输出小管注射到km白小鼠的曲细精管中，成功将外源基因导入睾丸组织，旨在探索一条新的、简单可行的建立转基因动物的途径。
 　　1材料和方法
　　1.1材 料
　　1.1.1试验动物清洁级40日龄雄性km小鼠6只，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。
　　1.1.2主要试剂质粒pegfp-c1（本实验室留存）。质粒提取试剂盒购于美国promega公司。脂质体lipofectamine 2000购自invitrogen公司。台盼蓝、dmem培养基、opti-men培养基购自gibco公司。引物合成由上海生工生物工程公司完成。动物组织dna基因组提取试剂盒购自天根生化科技有限公司。其它试剂均为国产分析纯。
 　　1.1.3试验器材体视解剖镜，玻璃管（100×0.1 mm），酒精灯，打火机，1 ml的注射器，手术器械（用前需消毒），台盼蓝（0.4%），生理盐水稀释的戊巴比妥纳（注射时浓度一般为1%）。
 　　1.2方 法
　　1.2.1质粒的转化提取pegfp-c1转化入空白感受态菌种，铺板并用卡那霉素筛选后，挑取阳性克隆，大量培养，用promega质粒提取试剂盒提取质粒，过滤除菌分装后，置-20 ℃备用。
 　　1.2.2注射用玻璃针的制作将玻璃管用酒精灯灼烧的办法拉成玻璃针，将针尖打磨成30°的斜面。一小段橡胶管一头连接注射器，一头连接拉好的玻璃针，准备注射使用。
 　　1.2.3转染液的配制按脂质体试剂lipofectamine2000说明书，把载体pegfp-c1与脂质体混合。具体操作过程如下，转染液a制备：将4 μg质粒加到100 μl无菌、无血清的opti-mem培养液中，并轻轻混匀。转染液b制备：将10 μl脂质体lipofectamine2000 与100 μl无菌、无血清的opti-mem培养液混匀，室温放置5 min。随后将a液与b液混合，37 ℃孵育20 min，最后加入2 μl 4%台盼蓝混匀，即可用于注射。

　　1.2.4睾丸输出小管的注射麻醉小鼠，注射时浓度一般为1%，腹腔注射。小鼠昏迷后，固定四肢于木板上，置于体视显微镜下。开腹：逐层打开腹腔，表皮至肌层。将睾丸拉出腹腔：于膀胱旁边寻找与睾丸相连的脂肪垫，轻轻拖出腹腔，小鼠的睾丸和附睾顺势被拖出腹腔。调节光源的亮度及显微镜放大倍数。用尖头镊找出输出小管（图1），并调整木板角度，使小鼠输出小管的方向大约与玻璃针方向平行。双手操作，夹起输出小管，将其中一段套入玻璃针头部，并顺势平行将输出管向玻璃针方向移动。左手固定输出小管位置，右手推动注射器，将转染液和台盼蓝的混合液慢慢注射进输出小管

内。然后看到蓝色的液体顺着曲精细管的走向慢慢的充满大部分曲精细管，使睾丸表面大部分曲精细管变蓝。注射结束后，将睾丸放回腹腔，逐层关腹，缝合。最后将碘酒棉敷于小鼠腹部防止感染。注射后小鼠单独饲养。
 　　1.2.5睾丸组织的石蜡切片 小鼠注射后，立即取一只小鼠将其睾丸做石蜡切片处理，观察转染液在曲细精管内的分布情况，按文献[7]里组织石蜡切片的方法进行。
　　1.2.6睾丸支持细胞的分离培养小鼠注射单独饲养1周后，取一只小鼠的睾丸进行睾丸支持细胞的分离培养，观察是否有荧光产生。按文献[8]的方法进行。
　　1.2.7睾丸组织曲细精管dna提取注射后小鼠单笼饲养4周后提取剩余4只小鼠睾丸组织曲细精管dna，按提取试剂盒说明书进行。
　　1.2.8转基因仔鼠的检测利用primer5软件设计egfp上、下游引物。上游引物序列为：5’-cagcagtcttccaacccaat-3’，下游引物序列为5’-tgagaggcgcacagaacatc -3 '。pcr 产物为314 bp。pcr反应体系包括：taq dna polyrases （ 5 u·μl-1） 0.5 μl、10×buffer 5 μl、dntp（ 各2.5 mmol·l-1） 4 μl、引物ⅰ、ⅱ（ 25 pmol·μl-1）各1 μl、pegfp-c1（ 500～1000 ng·μl-1） 1 μl 、dd h2o 37.5 μl。pcr 反应条件为94 ℃预变性5 min后，进入循环，94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，33个循环，72 ℃延伸10 min。1.0%的琼脂糖凝胶电泳。
 　　2结果与分析
　　2.1睾丸输出管注射后转染液在睾丸内的情况
　　转染液在曲细精管中的流动规律及分布：注射前期睾丸内压相对较小，只需轻微用力便可使转染液迅速地在曲细精管中流动（图2）。注射后期由于睾丸内压变大，尽管加大注射压力，但转染液在曲细精管中的流动速度没有太大变化。此时停止注射，一个睾丸大约需要注射80～100 μl转染液，时间大约10～20 min。通过睾丸输出管，可以使小鼠睾丸表面大约70%～80%的曲细精管充满转染液（图3），并且离睾丸输出管近的曲精细管转染液的充盈程度明显较远端高。
 　　2.2睾丸组织石蜡切片观察
　　睾丸组织经石蜡切片后，在显微镜下观察，曲细精管内部完全被转染液染为蓝色（图4），这表明转染液已经完全进入曲细精管管腔内，这样就大大提高了pegfp-c1整合到精原细胞的效率。
 　　2.3睾丸支持细胞的分离培养
　　支持细胞分离培养24 h后，在显微镜下观察发现有发出绿色荧光的细胞（图5、图6），这表明pegfp-c1已经整合到睾丸支持细胞内。
　　2.4 睾丸曲细精管的pcr鉴定
　　利用设计的引物，对4只睾丸曲细精管进行pcr鉴定，都是pcr阳性（图7）。
　　3结论与讨论
　　本试验采取的睾丸输出小管注射法，除此方法外，目前报道的还有睾丸网注射法[9]。ogawa等[10]报道了此两种移植方法具有相似的移植效率， 各有优缺点。睾丸网注射法不需要解剖游离输出小管[11]，但是直接睾丸网注射会由于这些纤维结缔组织的弹性， 加之睾丸网厚度不到0.2 mm， 很容易穿透睾丸网而导致细胞悬液渗漏到间质， 而且一旦穿破则很难补救[12]。经输出小管注射的方式具有快速可靠、渗漏少的特点。
 　　小鼠睾丸输出小管处在睾丸血管蒂的一侧，几乎与睾丸血管蒂大动脉平行，一端与睾丸相连，另一端与附睾联系。在进行睾丸输出管注射时，应将玻璃针的针尖与输出管平行，针尖与输出管的角度≤10°，针头一旦插入输出小管应始终保持插入针的平衡，如不小心将注射针从输出小管中脱出，要重新剥离一段输出管再进行注射。精原细胞通过分裂、生长和发育最后成为初级精母细胞。然后初级精母细胞经过两次成熟分裂，变为次级精母细胞和精子细胞[13]。精子细胞再经过一些形态变化，最后变为精子。精子由精原干细胞成熟分化而来，精原干细胞在雄性动物出生后，一直处于不断分裂增殖的状态[14]。将外源基因转染到曲细精管内的精原干细胞，使其整合到精原干细胞的染色体中，这样，就有可能使干细胞不断分化成熟的精子携带外源基因[15]。另外，小鼠睾丸支持细胞是曲细精管的上皮细胞，给精子的发生提供微环境，在精子发生中起重要的作用。本试验采用睾丸输出管注射法将脂质体包裹pegfp-c1表达载体注射到曲细精管中，石蜡切片观察到转染液已经完全进入曲细精管内，这样便大大提高了外源基因整合到曲细精管的效率。又经一周后分离培养睾丸的支持细胞，发现睾丸的支持细胞有绿色荧光产生，说明外源基因已经整合到睾丸的支持细胞内，而支持细胞对精子的发生具有重要的作用，这样便会源源不断地产生带有外源基因的精子，从而达到转基因的目的。后对其余4只小鼠的睾丸做了pcr检测，均显示为阳性，说明这几只小鼠已经构建成为转基因小鼠。
 　　本试验采用睾丸输出管注射法将外源基因导入曲细精管中，而不是睾丸直接注射[16]或者打点注射[17]，通过一个体内的转基因过程使得精子携带外源基因，获得转基因小鼠。过程简单，对于试验条件的要求相对低。更重要的是一旦精原细胞成功整合了外源基因，由于其自身的独特生物学性质，睾丸中便会源源不断地产生大量转基因精子。试验对于大的家畜等动物建立转基因模型具有重要的指导意义。

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